張穩(wěn)，孟淑君，王琪月，萬炯，馬拴紅，林源，丁冬，湯繼華

（河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】植物90%以上的干物質(zhì)是通過光合作用產(chǎn)生，且作物生物學產(chǎn)量主要來源于葉片的光合產(chǎn)物[1]。葉綠素含量是決定作物光合效率和生物學產(chǎn)量的重要因素[2]。光合作用在葉綠體（chloroplast）中進行，除了進行光合作用之外，葉綠體中還發(fā)生與植物生命活動相關(guān)的代謝過程，如淀粉的合成和轉(zhuǎn)運，葉綠素類、細胞色素類、蛋白質(zhì)等的合成[3]。葉綠素的合成是受核基因和質(zhì)體基因共同控制的復雜過程，其中，某些基因的突變會導致葉綠素合成減少，葉綠體發(fā)育受損，光合能力嚴重降低[4]?！厩叭搜芯窟M展】質(zhì)體是植物細胞中的一種特定細胞器，負責光合作用，并參與植物生長和發(fā)育[5-6]。質(zhì)體基因主要由2種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，核編碼RNA聚合酶（nuclear gene-encoded RNA polymerase，NEP）和質(zhì)體編碼RNA聚合酶（plastid-encoded RNA polymerase，PEP）[7-8]。質(zhì)體基因至少有3種不同類型的啟動子，2種不同來源的RNA聚合酶分別識別對應(yīng)啟動子調(diào)控基因的表達[9]?；趩幼拥慕Y(jié)構(gòu)，葉綠體基因可分為3類：依賴PEP指導轉(zhuǎn)錄的基因，包括psaA、psbE、psbB、psaB、psbA、rbcL和petD等；依賴NEP指導轉(zhuǎn)錄的基因，包括rpoB、accD、rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2和Ycf2等；需要2種聚合酶共同指導轉(zhuǎn)錄的基因，包括ndhB、ndhF、clpP、atpB和atpE等[10]。NEP主要介導葉綠體發(fā)育早期持家基因的表達，包括PEP核心亞單位和參與質(zhì)體基本功能的基因；而PEP負責80%以上葉綠體基因的表達，它指導產(chǎn)生完全活躍葉綠體所需的光合基因的轉(zhuǎn)錄[11-12]。PEP核心蛋白質(zhì)有2種存在形式：可溶性RNA聚合酶復合物（soluble RNA polymerase，sRNAP）和轉(zhuǎn)錄激活染色體復合物（transcriptionally active chromosome，TAC）[13-15]。PFALZ等[15]從擬南芥（Arabidopsis thaliana）和芥菜（Sinapis alba）中鑒定出18個新的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄激活染色體蛋白質(zhì)（plasid transcriptionally active chromosomes，pTACs），并對pTAC2、pTAC6和pTAC12等基因的缺失突變體進行研究，證實這三個基因是維持PEP的轉(zhuǎn)錄活性所必需的。在擬南芥中，pTAC12不僅影響葉綠體基因的表達，還調(diào)節(jié)細胞核基因的表達，尤其是在光敏色素信號傳導中起作用[16]。擬南芥和芥菜中的鐵超氧化物歧化酶FSD2和FSD3均是TAC復合物的組分[15]。雙突變體fsd3-1fsd2-1表現(xiàn)為嚴重的白化表型，葉綠體嚴重受損，對氧化應(yīng)激高度敏感，F(xiàn)SD2和FSD3通過保護葉綠體免受ROS的作用，清除早期葉綠體發(fā)育中的ROS進而維持葉綠體的正常發(fā)育[17]。擬南芥中AtpTAC4編碼32 kD囊泡誘導的葉綠體蛋白質(zhì)VIPP1，對類囊體的形成至關(guān)重要[18]。MARéCHAL等[19]報道了擬南芥中TAC復合物2種組分pTAC1/AtWhy1和pTAC11/AtWhy3，編碼這兩個蛋白基因的突變會造成葉綠體基因組的異常重組，導致葉綠體發(fā)育異常，表現(xiàn)為白化或幼苗致死。對擬南芥AtpTAC14的敲除導致在葉綠體發(fā)育的初期類囊體形成受阻，造成苗期白化致死；同時AtpTAC14可與AtpTAC12形成復合體，作為光敏色素依賴性光信號調(diào)節(jié)葉綠體基因表達[20]。pTAC3在轉(zhuǎn)錄的起始，延伸和終止期間與PEP形成復合物，對質(zhì)體PEP活性和葉綠素的合成是必需的[21]。擬南芥中AtpTAC7通過與4種pTACs組分FLN1、TAC10、TAC12和TAC14相互作用，在調(diào)節(jié)PEP依賴性葉綠體基因表達和葉綠體發(fā)育中起重要作用[22]。在水稻中對OsTRXz進行定點敲除，OsTRXz功能的缺失會造成水稻葉綠體的生物合成受阻，依賴PEP轉(zhuǎn)錄和翻譯基因被嚴重抑制，OsTRXz與OsFLN1、OsHSA1相互作用，共同參與組成PEP復合物的形成，在水稻葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄及葉綠體合成過程中必不可少[23]。在水稻葉色突變體中，葉綠素代謝異常通常會導致葉片黃化或滯綠的表型，如nyc1[24]和pao、rccr1[25]等突變體；而白化表型通常是由于葉綠體發(fā)育的異常造成的，如swl1[26]和al1[27]突變體。水稻中OspTAC2定位于葉綠體中，在osptac2純合突變體中葉綠體發(fā)育受損，葉綠素合成受阻。且PEP（質(zhì)體編碼RNA聚合酶）依賴性基因的轉(zhuǎn)錄水平在突變體中較CK顯著降低，而NEP（核編碼RNA聚合酶）依賴性基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。表明OspTAC2在葉綠體發(fā)育和葉綠素合成中起關(guān)鍵作用，并表明OspTAC2的分子功能在水稻和擬南芥中是保守的[28]?！颈狙芯壳腥朦c】雖然pTACs復合物各成員在擬南芥中報道較多，但在大田作物（包括玉米）中的研究仍然較為欠缺。ZmpTAC2經(jīng)鑒定是擬南芥和水稻質(zhì)體轉(zhuǎn)錄活性染色體蛋白2（pTAC2）基因的直系同源基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對ZmpTAC2進行定點突變，轉(zhuǎn)基因純合突變單株表型為葉片白化并且苗期致死，體內(nèi)葉綠素含量較CK顯著降低，葉綠素合成途徑受阻且葉綠體發(fā)育缺陷。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2轉(zhuǎn)基因陽性純合突變材料（zmptac2）為研究對象，對CK和zmptac2幼苗時期葉片取樣進行RNA-seq研究，利用qRT-PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，并結(jié)合葉綠素含量測定及酵母雙雜交等技術(shù)，篩選和鑒定參與葉綠素合成的相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以玉米自交系KN5585為背景材料，利用未米生物科技（江蘇）有限公司開發(fā)的高通量CRISPR/Cas9靶點設(shè)計程序，對ZmpTAC2（Zm00001d022599）的第一個外顯子上ATG下游1 319 bp的PPR結(jié)構(gòu)域上設(shè)計了2個相距136 bp的編輯靶位點。構(gòu)建目的載體CRISPR/Cas9-ZmpTAC2，運用農(nóng)桿菌侵染的方法導入玉米自交系KN5585中。轉(zhuǎn)基因后共獲得15個獨立T0轉(zhuǎn)基因苗，其中，葉片表現(xiàn)為正常綠色7株，白化表型8株。

1.2 轉(zhuǎn)基因株系陽性鑒定

采用CTAB法提取基因組DNA[29]，利用引物（JC-F：5′-CCGTGTCCTGCTCGATTT-3′和JC-R：5′-CTTCCTGCATACCGAGAAGGT-3′）檢測轉(zhuǎn)基因材料的編輯情況。PCR反應(yīng)程序為95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 8 min。將PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，并分析測序結(jié)果。

1.3 潛在脫靶位點分析

使用CRISPR RGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）在線BLAST工具，將ZmpTAC2靶序列在玉米全基因組中進行比對，選取與靶序列同源性較高、錯配≤4 bp，且具有PAM序列NGG的位點作為潛在脫靶序列，通過單克隆測序評估其脫靶效應(yīng)。

1.4 zmptac2突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

參考文獻[30]制作葉片的透射電鏡樣品。去除幼苗葉脈，切成2 mm×2 mm的小片，立即放入2.5%戊二醛（pH=7.4）中，抽真空30 min使葉片完全下沉后，室溫放置2 h，4℃過夜；PBS緩沖液室溫固定5 h；用不同濃度無水乙醇/丙酮溶液梯度脫水；酮/812包埋劑包埋64 h；使用超薄切片機制備60—80 nm超薄切片之后鈾鉛雙染色，使用HITACHI HT7700型透射電子顯微鏡觀察、拍照（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.5 葉綠素含量的測定

根據(jù)先前報道的分光光度法測定光合色素含量[31]。切下葉片（約0.2 g鮮重），并在1 mL 100%丙酮中均化，用80%丙酮處理葉片。使用UV-2000分光光度計（尤尼龍，UV-2000），在663 nm和645 nm波長下測定吸光值，按照下列公式計算葉綠素含量。

葉綠素a含量（mg·g-1）= (12.72A663-2.59A645)×Vs×稀釋倍數(shù)/Fw；

葉綠素b含量（mg·g-1）=(22.88A645-4.67A663)×Vs×稀釋倍數(shù)/Fw；

葉綠素總含量（mg·g-1）=葉綠素a含量+葉綠素b含量。

式中，F(xiàn)w（fresh weight）為樣品鮮重；Vs為提取液總體積（mL）。

1.6 苗期葉片RNA提取、轉(zhuǎn)錄組建庫及測序

使用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）提取幼苗葉片總RNA，并用不含RNase的DNA酶I（TaKaRa，Japan）處理，以獲得純凈RNA。使用NanoDrop One檢測RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量，同時用Agilent 2100檢測28S/18S以及RIN值。根據(jù)Illumina標準RNA-seq文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建鏈特異性文庫，使用雙端測序方法進行測序（北京貝瑞和康生物科技有限公司）。

1.7 測序結(jié)果分析

測序得到原始數(shù)據(jù)后使用FastQC[32]進行質(zhì)控，根據(jù)質(zhì)控結(jié)果，使用Trimmomatic[33]進行過濾。以B73_V4基因組為參考（B73 AGPv4，ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-42/fasta/zea_mays/dna/），使用HiSat2[34]軟件將過濾后的數(shù)據(jù)進行比對，reads的統(tǒng)計使用featureCounts[35]軟件。使用R軟件包DESeq2[34]進行基因的差異表達分析，其中p.adjust≤0.01及表達差異倍數(shù)大于2的基因認為是差異表達基因（DEGs）。利用R軟件包中的Cluster Profiler[36]進行差異基因的GO富集及KEGG富集分析。

1.8 qRT-PCR驗證

選擇15個差異表達的基因進行qRT-PCR驗證。以CK和zmptac2的葉片總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，使用NCBI Primer Blast在線設(shè)計qRT-RCR反應(yīng)基因特異引物（電子附表1）。cDNA反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）和TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa）試劑盒說明書進行，每個試驗均設(shè)3個生物學重復和3個技術(shù)重復。以Zm-β-actin作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法[37]分析基因相對表達水平。

1.9 酵母單雜交轉(zhuǎn)錄激活活性分析

按照YE等[38]改進的方法進行轉(zhuǎn)錄激活活性分析。將含有pG221質(zhì)粒的酵母菌株EGY48接進50 mL SD/-Ura培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)16—20 h測A600=1.6—2.0，轉(zhuǎn)接OD600=0.2—0.3，30℃，220 r/min 2.5—3.5 h，使終濃度OD600=0.4—0.6，取菌液制作酵母感受態(tài)，將pGBKT7-ZmpTAC2和pGBKT7-ZmpTAC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂SD/-Trp/-Ura培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2—3 d，將長出的酵母菌落在SD/-Trp/-Ura+X-gal顯色平板上劃線，30℃培養(yǎng)2 d后觀察顯色情況。

1.10 ZmpTAC2互作蛋白捕捉

使用酵母雙雜交系統(tǒng)探究ZmpTAC2蛋白質(zhì)的互作蛋白。以B73葉片cDNA為模板，PCR擴增獲得ZmpTAC2的全長序列，并將此序列與PGBKT7載體連接構(gòu)建pGBKT7-ZmpTAC2為誘餌載體，轉(zhuǎn)化Y2HGold菌株。驗證誘餌蛋白ZmpTAC2的毒性及誘餌載體pGBKT7-ZmpTAC2的自激活特性。將含有pGBKT7-ZmpTAC2的酵母Y2HGold與含有玉米cDNA文庫的質(zhì)粒用共轉(zhuǎn)的方法進行雜交。在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上篩選，用pGBKT7-AD通用引物pGADT7-F：5′-TAATACGACTCACTATAG GG-3′和pGADT7-R：5′-AGATGGTGCACGATGCAC AG-3′進行菌液PCR擴增。擴增獲得的PCR片段送交北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果使用NCBI BLAST進行比對分析，挑選候選基因進行點對點回轉(zhuǎn)驗證。

2 結(jié)果

2.1 zmptac2表型及轉(zhuǎn)基因植株陽性編輯情況

對獲得的15株T0幼苗進行轉(zhuǎn)基因陽性鑒定，發(fā)現(xiàn)7株綠色幼苗中有3株為轉(zhuǎn)基因陰性，4株為轉(zhuǎn)基因陽性；8株白化幼苗全部表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因陽性。對12株轉(zhuǎn)基因陽性材料使用特異引物對含有雙靶點的序列進行克隆和靶位點編輯檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性綠色幼苗中2株為未編輯，2株為雜合編輯突變，8株白化幼苗為純合編輯突變，共包含多堿基位點編輯（5株）、158—165 bp的大片段的缺失（4株）及倒位片段重連接（1株）等多種不同編輯導致的突變方式（圖1-B，電子附圖1）。對轉(zhuǎn)基因陰性材料命名為CK，白化表型且純合編輯的8株突變材料命名為zmptac2（圖1-A）。其中，白化表型的zmptac2-1缺失165 bp、zmptac2-2缺失163 bp、zmptac-3缺失161 bp、zmptac-4缺失158 bp，造成ZmpTAC2蛋白質(zhì)翻譯提前終止；zmptac2-5在靶位點1缺失1 bp，在靶位點2缺失3 bp；zmptac2-6在兩靶位點間存在163 bp長片段的倒位（圖1-B）。將zmptac2-1、zmptac2-2用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序。RNA-seq結(jié)果顯示，zmptac2突變體中ZmpTAC2表達量顯著降低（CK：3 395.3 RPM，zmptac2：363.2 RPM）。利用qRT-PCR技術(shù)，測定CK與zmptac2中ZmpTAC2的相對表達量。結(jié)果顯示，突變體中ZmpTAC2表達量顯著降低，這與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

2.2 zmptac2突變體脫靶效應(yīng)評估

CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的主要取決于sgRNA序列的特異性識別，但由于高等生物基因組較大且較為復雜，sgRNA可能會與非靶點DNA序列發(fā)生局部錯配，造成CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的脫靶。因此，需要對ZmpTAC2突變體脫靶效應(yīng)進行評估，選取玉米基因組中與2個sgRNA序列錯配堿基數(shù)在4 bp以內(nèi)且具有PAM序列的位點作為潛在脫靶位點，每個靶位點選取3個，共6個（表1），使用NCBI Primer Blast在線設(shè)計檢測引物（電子附表1）。所選取的8個突變單株的6個潛在脫靶，這6個潛在脫靶位點在T0均未產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（電子附圖2），表明所設(shè)計的sgRNA序列具有較高的特異性。

2.3 zmptac2突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)及葉綠素含量測定

利用透射電鏡觀察了對照（CK）和突變體（zmptac2）幼葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖2-A）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因陰性（CK）具有完整的葉綠體結(jié)構(gòu)，基粒類囊體折疊整齊而致密，而zmptac2突變體幼葉的葉綠體內(nèi)基粒類囊體基粒數(shù)目明顯少，且排列不規(guī)則，基質(zhì)片層清晰可見，質(zhì)體小球數(shù)目增多，表明葉綠體異常發(fā)育。由此推斷突變體zmptac2的白化表型可能是通過葉綠體的異常發(fā)育而造成的。

針對白化表型，對CK和zmptac2突變體中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量進行了測定分析。結(jié)果顯示，與CK相比zmptac2中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量顯著降低（圖2-B）。

圖1 CK與zmptac2的表型鑒定及靶位點檢測Fig.1 Phenotypic identification and target site detection of CK and zmptac2

表1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)潛在脫靶位點突變檢測Table 1 Mutations detected in the putative CRISPR/Cas9 off-target sites

2.4 CK與zmptac2幼苗葉片轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

選取CK材料苗期葉片2份和zmptac2的純合突變材料（圖1，zmptac2-1和zmptac2-2）苗期葉片2份用于RNA提取及后續(xù)測序。所測數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴格的質(zhì)控后，產(chǎn)生0.48億對雙末端序列，共計45.3 Gb的序列數(shù)據(jù)。所測樣品Q30比例均超過90%，GC含量均低于50%，比對到參考基因組的比例均在95%以上，結(jié)合以上數(shù)據(jù)可以說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，符合進一步的生物信息學分析要求（表2）。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Table 2 Output statistics of sequencing analysis

2.5 差異表基因的表達分析及GO功能富集分析

使用p.adjust≤0.01和差異倍數(shù)大于2倍以上為差異表達基因篩選的閾值。在zmptac2-vs-CK中共檢測到1 367個差異表達基因，其中618個基因上調(diào)表達，749個基因下調(diào)表達（電子附表2和電子附表3）。對1 367個差異表達基因做GO（gene ontology）注釋，按照基因的細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及參與的生物學過程（biological process，BP）進行分類統(tǒng)計。對差異表達基因進行GO功能富集分析，共得到次級分支45個，其中，生物學過程含有16個次級分支，分子功能含有12個次級分支，細胞組分含有17個次級分支（這里僅展示前22條，圖3）。

圖3 差異表達基因GO富集分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes in GO enrichment

根據(jù)GO注釋結(jié)果，上調(diào)表達的基因主要富集在細胞周期過程的調(diào)節(jié)、細胞修飾的氨基酸代謝過程的調(diào)節(jié)等過程。下調(diào)表達的基因主要富集質(zhì)體基質(zhì)（20個）、葉綠體基質(zhì)（20個）、葉綠體（51個）和質(zhì)體（51個）等細胞組分，表明ZmpTAC2主要通過調(diào)控葉綠體相關(guān)途徑來調(diào)節(jié)葉綠素的合成途徑。

2.6 差異表達基因Pathway富集分析

對差異表達的1 367個基因進行生物學代謝途徑（pathway）富集分析，差異基因主要富集在13個代謝途徑上（圖4）。其中上調(diào)基因主要富集在谷胱甘肽代謝途徑（glutathione metabolism）、色氨酸生物合成（tryptophan biosynthesis）等途徑（圖4-A）；下調(diào)基因主要富集在苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）和異喹啉生物堿生物合成（isoquinoline alkaloid biosynthesis）等多種氨基酸代謝途徑（圖4-B）。

2.7 qRT-PCR驗證

根據(jù)差異表達的顯著性及差異表達基因的功能，挑選15個差異表達基因（表3）進行實時熒光定量PCR以驗證RNA測序數(shù)據(jù)的準確性。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖5），這些差異基因在CK與zmptac2材料間的表達模式均與測序數(shù)據(jù)相一致，表明RNA-seq測序結(jié)果是可靠的。

圖4 差異表達基因KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

圖5 zmptac2與CK差異基因的qRT-PCR表達分析Fig.5 qRT-PCR expression analysis of zmptac2 and CK differential genes

表3 qRT-PCR驗證的差異表達基因Table 3 Differentially expressed genes verified by qRT-PCR

在擬南芥中，已經(jīng)證實OspTAC2功能缺失時會造成PEP活性降低，進而引起PEP轉(zhuǎn)錄的質(zhì)體基因表達降低，同時促進核編碼的RNA聚合酶（NEP）轉(zhuǎn)錄基因的表達[24]。據(jù)此推測ZmpTAC2也參與調(diào)控玉米PEP的活性，進而影響玉米葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄。為了驗證這一推測，在ZmpTAC2轉(zhuǎn)基因陽性株中，對PEP轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的表達量進行了檢測。選擇PEP依賴的基因rbcL、psa A、psbA、psaB和psbK，以及NEP依賴的基因rpoA、rpoB、rpoC1和rpoC2進行相對表達量的測定。結(jié)果顯示，與CK相比，zmptac2中對PEP依賴的基因在RNA水平上表達量顯著降低（圖6-A），而NEP依賴的基因表達量則顯著上升（圖6-B）。說明ZmpTAC2對依賴PEP基因的轉(zhuǎn)錄具有直接影響，而對依賴NEP基因的轉(zhuǎn)錄似乎存在反饋調(diào)控。

2.8 酵母雙雜及轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為進一步研究ZmpTAC2在玉米細胞內(nèi)的功能，通過篩選相互作用蛋白，找到了與ZmpTAC2共同調(diào)控葉綠體發(fā)育和葉綠素合成的蛋白。通過驗證，在SD/-Trp培養(yǎng)基上誘餌蛋白ZmpTAC2生長良好，無毒性（圖7-B）；pGADT7+pGBKT7-ZmpTAC2在SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上無法生長，證明誘餌載體pGBKT7-ZmpTAC2無自激活（圖7-C）。確定誘餌載體pGBKT7-ZmpTAC2可以用于直接與玉米cDNA文庫雜交。通過篩選，共獲得了120個陽性克隆。對陽性克隆進行菌落PCR的鑒定，隨后在NCBI BLAST上進行序列比對。去除發(fā)生移碼突變的基因及未注釋的基因，共得到32個可能與pTAC2互作的蛋白（表4）。進一步分析這些基因，發(fā)現(xiàn)其中16個為核基因編碼蛋白，10個為葉綠體基因編碼蛋白。例如核編碼的ZmpTAC3、α/β水解酶、histone H2A和CPN60等基因；葉綠體編碼的CRS1、ATP-dependent DNA helicase等基因。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，將ZmpTAC3（Zm00001d032790）、CPN60（Zm00001d038857）和ATP-dependent DNA helicase（Zm00001d007417）定為候選基因進行點對點驗證。結(jié)果表明，ZmpTAC2和ZmpTAC3在酵母系統(tǒng)中存在互作（圖7-D）。

表4 酵母雙雜篩庫獲得ZmpTAC2的互作蛋白質(zhì)Table 4 Yeast two-hybrid system sieve library obtains ZmpTAC2 inter-made proteins

將pG221（表達GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域）與ZmpTAC2和ZmpTAC3的融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母中，發(fā)現(xiàn)ZmpTAC2和ZmpTAC3各自并不能使GAL4順式序列調(diào)控下的報告基因LacZ得到表達形成藍色菌落（圖7-A）。證明ZmpTAC2和ZmpTAC3蛋白在酵母中不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。初步說明葉綠素的合成需要質(zhì)體基因間及質(zhì)體基因組和核基因組之間的相互協(xié)調(diào)作用。

圖6 zmptac2突變體內(nèi)依賴PEP和NEP的相關(guān)基因相對表達量Fig.6 zmptac2 mutations in the body rely on PEP, NEP related gene relative expression

圖7 轉(zhuǎn)錄激活分析及互作蛋白篩選Fig.7 Transcriptional activation analysis and interaction protein screening

3 討論

已有大量研究證明大部分白化和幼苗致死突變體在葉綠體發(fā)育或葉綠素合成等方面存在缺陷，這表明葉綠素合成對植物生長和發(fā)育至關(guān)重要[39-40]。在本研究中，ZmpTAC2純合突變轉(zhuǎn)基因材料，顯示出白化表型，白化苗不能正常存活，苗期死亡。當ZmpTAC2功能缺失時，zmptac2純合突變轉(zhuǎn)基因材料的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b的含量較CK顯著降低（圖2）。這表明白化表型是由ZmpTAC2突變引起的，ZmpTAC2是葉綠素合成和正常植物生長所必需的。這些結(jié)果與其他植物中報道的TAC相關(guān)突變體相似[24]。ZmpTAC2是水稻和擬南芥pTAC2的同源基因（80%和50%氨基酸同一性），且和水稻、擬南芥ptac2突變體有相似的表型，這表明pTAC2基因的分子功能在玉米、水稻和擬南芥之間是保守的。此外，ZmpTAC2與其在其他植物物種中的同源基因的氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析表明ZmpTAC2在高等植物中是進化上保守的（電子附圖3）。

對ZmpTAC2定點編輯后，白色表型材料為編輯陽性純合突變。經(jīng)靶點檢測分析結(jié)果表明，編輯主要為3種狀態(tài)（圖1-B），第一種為2個靶位點間存在約150 bp左右的長片段缺失，造成ZmpTAC2蛋白質(zhì)翻譯提前終止；第二種為第一個靶點單堿基缺失，第二個靶點缺失4個堿基；第三種為兩靶點間片段倒位重連。這些編輯均造成了白化表型。在ZmpTAC2的相同基因區(qū)域發(fā)生這些不同類型的編輯，說明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯可獲得不同的編輯效果。包括兩個靶位點間的片段缺失（圖1-B，zmptac2-1、zmptac2-2、zmptac2-3和zmptac2-4），是由Cas9蛋白對2個靶位點PAM序列同時編輯所致；2個靶位點分別編輯（圖1-B，zmptac2-5），說明發(fā)生在2個位點的編輯事件是相對獨立發(fā)生的；2個靶位點之間片段的倒位在1個編輯陽性事件中被檢測到（圖1-B，zmptac2-6），說明在2個靶位點間發(fā)生剪切后產(chǎn)生的DNA片段可用作斷裂DNA雙鏈修復的原料。綜上，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯時，使用目標基因內(nèi)相近（100—200 bp）外顯子區(qū)域的2個靶位點可增加陽性編輯事件產(chǎn)生的類型，進而提高編輯效率。

根據(jù)GO富集分析及KEGG富集分析，下調(diào)基因GO注釋富集在質(zhì)體中；KEGG注釋顯示下調(diào)基因在苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝顯著富集（圖3和圖4；電子附表2和電子附表3），與葉綠體、類囊體，PSⅠ和PSⅡ及DNA結(jié)合蛋白有關(guān)。苯丙氨酸在人體相關(guān)酶的作用下，可以轉(zhuǎn)化成酪氨酸。若苯丙氨酸和酪氨酸代謝異常，則會產(chǎn)生白化病[41]。RNA-seq測序發(fā)現(xiàn)，CtpA3、RPS4A等在白化材料中的表達量顯著高于CK。利用qRT-PCR技術(shù)驗證測序的表達模式，證明這些基因在zmptac2突變體中較CK表達量顯著上調(diào)，且差異倍數(shù)較大。NAKAMURA等[42]研究表明，光合相關(guān)基因的調(diào)控基因glk突變，葉綠素合成及葉綠體發(fā)育受到影響，導致植株光合效率降低。擬南芥中調(diào)控葉綠素合成HEMA1的基因突變，導致葉綠素合成過程中鎂離子結(jié)合效率降低，光合效率下降[43]。核糖體蛋白（RPs）在核糖體生物合成和蛋白質(zhì)合成中是必不可少的，并且在多種發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[44]。核糖體蛋白S4（ribosomal protein small subunit 4，RPS4）在原核生物和植物葉綠體的核糖體30S小亞基形成起始過程中起重要作用；在植物體中，該蛋白由葉綠體rps4編碼[45]。CtpA是D1蛋白的羧基末端加工蛋白酶，在菠菜和大麥中CtpA由單拷貝核基因編碼，CtpA蛋白僅在黃化材料中檢測到，且定位于類囊體腔中[46]。本研究zmptac2突變體中光合作用相關(guān)基因CtpA、psb1和RPS4的表達量顯著高于CK，而葉綠素的合成依然受阻。說明ZmpTAC2與Psb位于葉綠素合成的不同代謝途徑，zmptac2突變直接影響葉綠素的合成，導致白化葉片表型；而葉綠素合成受阻作為一種反饋信號，誘導了CtpA、psb1和RPS4等基因的表達。

本研究中，Cyc基因家族中多個成員、Histone及ClpC1在zmptac2突變體中較CK顯著下調(diào)。細胞分裂是所有生命體的基本特征之一，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用[47]。細胞周期是細胞生命活動的重要過程，細胞周期和生長調(diào)控均取決于一類重要的細胞分裂調(diào)控因子-細胞周期蛋白（Cyclin）。如果細胞周期調(diào)控異常，細胞將進入病理狀態(tài)，甚至死亡[48]。細胞周期蛋白cyclin B1與細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs）結(jié)合，通過磷酸化調(diào)節(jié)多種蛋白的活性與分布而參與紡錘體的形成和染色體的分離[49]。Cyclin A2型細胞周期蛋白，有助于微調(diào)植物發(fā)育過程中的局部增殖。CYCA2的轉(zhuǎn)錄下調(diào)代表了在植物發(fā)育過程中協(xié)調(diào)增殖的關(guān)鍵機制[50]。ClpPRS復合物是葉綠體生物發(fā)生，類囊體蛋白穩(wěn)態(tài)和植物發(fā)育的核心[51]。CLP蛋白酶是ATP依賴性酪蛋白溶解蛋白酶，ClpC1可以促進蛋白酶復合物活性、葉綠體前蛋白的易位并介導蛋白質(zhì)降解[52]。蛋白質(zhì)組學分析表明clpc1中光系統(tǒng)蛋白質(zhì)豐度降低，而Hsp70、Cpn60和一些RNA結(jié)合蛋白上調(diào)。擬南芥中ClpC1定位在類囊體表面，ClpC1突變后導致葉片褪綠和延遲生長[53]。本文中突變體表現(xiàn)為白化表型，葉綠體發(fā)育異常，葉綠素含量降低，ClpC1和CPN60顯著降低。本研究在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中檢測到zmptac2突變體中與細胞分裂相關(guān)的Cyclin、與染色質(zhì)重塑相關(guān)的Histone及與葉綠體發(fā)育相關(guān)的ClpC1均較CK表達量降低。該結(jié)果暗示在突變體中，也許染色質(zhì)趨于開放，細胞周期的異常，導致細胞分裂嚴重受阻，這可能是造成突變體葉綠體發(fā)育異常表型的部分原因。

4 結(jié)論

ZmpTAC2定點編輯的陽性純合單株表現(xiàn)出嚴重的白化且幼苗致死；編輯陽性單株葉綠體發(fā)育異常，葉綠素含量顯著降低；依賴PEP轉(zhuǎn)錄的基因表達量顯著降低。ZmpTAC2是玉米葉綠素合成的重要調(diào)節(jié)基因，且是通過調(diào)控PEP相關(guān)基因表達而實現(xiàn)的。