蘇畢·阿吉 尹洪超

尿酸(uric acid，UA)作為體內(nèi)嘌呤代謝產(chǎn)物，是血漿中主要的抗氧化物之一，能有效抵抗氧自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激[1]。然而在人類進(jìn)化中，由于丟失了尿酸酶這一基因，導(dǎo)致人體血液中的UA比其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)高出10倍左右。當(dāng)人體血尿UA濃度高于6.8mg/dl時(shí)被定義為高尿酸血癥。近年來的流行病研究結(jié)果顯示，高尿酸血癥與多種心血管疾病的病理過程相關(guān)，如高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等，然而UA在其中的病理生理學(xué)作用仍有待于進(jìn)一步研究[2～4]。內(nèi)皮細(xì)胞作為血管的第1層屏障和內(nèi)分泌細(xì)胞，通過旁分泌作用分泌多種血管活性物質(zhì)和炎性細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)血管功能方面起著重要作用[5]。內(nèi)皮細(xì)胞活化被Pober等[6]研究者定義為，內(nèi)皮細(xì)胞在損傷因素的刺激下改變了蛋白質(zhì)的合成，并以細(xì)胞因子的形式傳遞細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生活化時(shí)，選擇素、黏附分子、趨化分子等炎性介質(zhì)表達(dá)增加，從而參與心血管等疾病的使動(dòng)環(huán)節(jié)[7]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族蛋白3(NLRP3)炎性體是由NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和胱冬肽酶-1前體(pro-caspase-1)組成的異源三聚體。被激活時(shí)，NLRP3蛋白募集銜接蛋白ASC，ASC募集下游失活狀態(tài)的pro-caspase-1[8]。該炎性體復(fù)合物的聚合會(huì)使pro-caspase-1自我催化形成活化狀態(tài)的caspase-1。活化的caspase-1切割游離的IL-1β前體(pro-IL-1β)形成成熟的IL-1β并釋放于胞外。普遍認(rèn)為，NLRP3炎性體通路需要兩步激活[9]。第一步需要炎性體啟動(dòng)(inflammasome priming)信號(hào)，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)NLRP3和pro-IL-β的轉(zhuǎn)錄翻譯，使其表達(dá)量上調(diào)，為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控；第二步為炎性體活化(inflammasome activation)信號(hào)，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)NLRP3炎性體復(fù)合物的募集，如形成NLRP3-ASC復(fù)合物等，為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。多種配體可作為NLRP3炎性體的啟動(dòng)信號(hào)刺激物，包括作用于Toll樣受體4(TLR4)的脂多糖(LPS)和作用于TLR2的Pam3CSK4均激活NF-κB通路從而促進(jìn)NLRP3和pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄[10]。多種刺激物可作為NLRP3的活化信號(hào)，包括UA晶體、ATP等，他們共同的作用機(jī)制可能通過ROS生成、溶酶體降解或陽離子外流等途徑[11～13]。

NLRP3炎性體是固有免疫的重要組成部分，其主要作用是識(shí)別非微生物危險(xiǎn)信號(hào)并誘發(fā)無菌性炎性反應(yīng)參與各種炎性慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。近期許多研究結(jié)果顯示，UA作為一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，不僅單鈉尿酸鹽(MSU)能激活NLRP3炎性體，溶解性UA也能激活NLRP3，如在小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞、大鼠心肌細(xì)胞、人單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等[15～19]。目前并不了解溶解性UA是否能激活人內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性體通路并影響其功能。已有研究報(bào)道，200μg/ml的可溶性高濃度UA作用于內(nèi)皮細(xì)胞，并通過HMGB1/RAGE通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[20]。且200μg/ml以上的UA在低溫下可能會(huì)析出[21]。因此，本研究用高濃度(200μg/ml)可溶性UA明確高濃度UA是否對(duì)HUVECs NLRP3炎性體通路有顯著影響。

材料與方法

1.材料:原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium, ECM)購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；尿酸(uric acid, UA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(RR820A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)(P1511)、抗β-tubulin單克隆抗體(C1340)、HRP標(biāo)羊抗小鼠二抗(C1308)、HRP標(biāo)羊抗兔二抗(C1309)和活性氧檢測(cè)試劑盒(S0033)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；NLRP3一抗(ab214185，ab4207)、IL-1β一抗(ab9722)、ASC一抗(ab155970)、羊抗兔熒光標(biāo)記IgG(ab96899)和驢抗羊熒光標(biāo)記IgG(ab150131)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；P65一抗(D14E12)購(gòu)自美國(guó)CST公司；TRIzol(15596026)和驢抗兔熒光標(biāo)記IgG(A21206)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)方法：HUVECs用含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑 (ECGS，Cat.No.1052)的ECM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，融合至80%～90%時(shí)胰酶按1∶3傳代，取4～7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.UA溶液配制：參考如前所述的方法配制200μg/ml的UA溶液[21]：將稱取好的UA粉末直接添加至ECM，37℃孵育40min，并每隔10min上下顛倒混勻。待UA粉末完全溶解，用0.22μm濾器過濾至無菌容器中。尿酸酶法檢測(cè)UA濃度，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行矯正，再次確認(rèn)濃度，4℃保存，并1周內(nèi)用完。

4.RNA提取和qPCR檢測(cè)：取第4～5 代細(xì)胞，前1天將細(xì)胞傳代至6cm皿，次日更換200μg/ml的UA培養(yǎng)液并培養(yǎng)24h。用TRIzol(1毫升/皿)收集各組細(xì)胞，在預(yù)處理過的無RNase環(huán)境抽提細(xì)胞RNA。用微量分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度，并按RT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，AT311)流程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)qPCR試劑盒(RR820A)說明進(jìn)行qPCR反應(yīng)。β-actin作內(nèi)參，以2-ΔΔCt值計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

5.Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：細(xì)胞處理同qPCR。其中LPS(500ng/ml，12h)作陽性對(duì)照。用Western blot法及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)公司，P0013)提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后95℃金屬浴10min，并取10μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至NC膜上。用5% BSA室溫封閉1h，分別加入β-tubulin一抗(1∶5000)、NLRP3一抗(1∶200)及IL-1β一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日，TBST洗5min×4次，加入相應(yīng)二抗(1∶5000)，室溫孵育1h。TBST洗5min×8次，ECL發(fā)光、顯影。采用Image J圖像處理軟件分析各蛋白灰度值。以tubulin為內(nèi)參，目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值算出目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

6.免疫熒光染色：將HUVEC以密度1.5×105接種于24孔板爬片過夜培養(yǎng)，并用200μg/ml UA處理細(xì)胞24h或500ng/ml LPS處理12h(陽性對(duì)照)。4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗3次，含0.3% Triton X-100的5%BSA室溫封閉60min。棄上清加入P65一抗(1∶400)4℃過夜。次日，PBS洗3次加入羊抗兔二抗(1∶250)室溫避光孵育1h，PBS洗3次，含DAPI甘油封片，并用共聚焦顯微鏡拍照。至于NLRP3和ASC雙染實(shí)驗(yàn)采用依次孵育的方法，即先孵育NLRP3一抗(1∶200)4℃過夜，之后室溫避光孵育1h驢抗羊紅色熒光二抗(1∶500)，再孵育ASC一抗(1∶250)4℃避光過夜，最后室溫避光孵育1h驢抗兔綠色熒光二抗(1∶500)，含DAPI甘油封片并拍照。采用對(duì)照組調(diào)整背景熒光強(qiáng)度后固定條件，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組拍攝5～10個(gè)視野。

7.ROS檢測(cè)：采用DCFH-DA法。細(xì)胞處理同免疫熒光染色。各組在培養(yǎng)6h時(shí)分別加入1∶1000稀釋的 DCFH-DA(終濃度10μmol/L)，繼續(xù)37℃避光孵育45min。遇冷PBS洗3次，1%多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗3次，含DAPI甘油封片，及時(shí)用共聚焦顯微鏡觀察并拍照，并采用Image J圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)各組照片中平均細(xì)胞光密度(IOD)值。

結(jié) 果

1.UA誘導(dǎo)表達(dá)HUVECs黏附分子和趨化因子mRNA：200μg/ml的UA誘導(dǎo)HUVECs的黏附分子ICAM-1和E-選擇素mRNA水平上調(diào)(圖1中A、B)。其中ICAM-1表達(dá)量上調(diào)約5倍(P=0.000)，E-選擇素表達(dá)量上調(diào)約2倍(P<0.01)。此外，200μg/ml的UA誘導(dǎo)HUVECs的趨化因子CXCL10和CCL26 mRNA表達(dá)量上調(diào)(圖1中C、D)，且CXCL10和CCL26 mRNA均上調(diào)5倍左右(P=0.000,P<0.01)。

2.UA降低HUVECs內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA水平：由圖2可見，與對(duì)照組比較，200μg/ml UA組eNOS mRNA表達(dá)量下調(diào)約2.4倍，提示溶解性高UA下調(diào)eNOS表達(dá)量。

3.UA對(duì)HUVECs NLRP3炎性體核酸和蛋白水平的影響：用LPS作陽性對(duì)照顯示，細(xì)胞NLRP3和pro-IL-1β蛋白水平均顯著上調(diào)(圖3中C、D)，且切割后成熟IL-1β水平也增加到約2倍。然而，200μg/ml的可溶性UA對(duì) HUVECs內(nèi)NLRP3、pro-IL-1β的mRNA(圖3中A、B)和蛋白水平?jīng)]有顯著影響(圖3中C、D)，且未切割形成成熟的IL-1β(圖3中C、D)?？扇苄愿遀A對(duì)HUVECs NLRP3和pro-IL-β轉(zhuǎn)錄水平無顯著影響。由圖4可見，200μg/ml UA刺激HUVECs 24h后，未檢測(cè)到NF-κB核移位。而陽性組LPS明顯上調(diào)了HUVECs的NF-κB表達(dá)并激活入核?？扇苄愿遀A對(duì)HUVECs NF-κB通路無明顯的刺激作用。

圖1 UA誘導(dǎo)HUVECs黏附分子和趨化因子mRNA表達(dá)用200μg/ml的可溶性UA刺激HUVEC 24h，并通過qPCR檢測(cè)黏附分子ICAM-1、E-選擇素和趨化因子CXCL10、CCL26 mRNA水平。數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，*P<0.01, **P=0.000

圖2 qPCR檢測(cè)eNOS mRNA表達(dá)量用200μg/ml的可溶性UA刺激HUVEC 24h，并通過qPCR檢測(cè)eNOS mRNA水平。數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，*P<0.01

4.UA誘導(dǎo)HUVECs內(nèi)NLRP3-ASC復(fù)合體形成：200μg/ml UA誘導(dǎo)NLRP3-ASC共定位，可溶性高UA促進(jìn)了HUVECs 內(nèi)NLRP3-ASC復(fù)合體形成(圖5)。

5.UA上調(diào)HUVECs ROS水平：HUVECs胞質(zhì)ROS水平顯著增高(圖6中A、B,P=0.000)。

討 論

心血管疾病是世界上高發(fā)生率和高病死率的疾病之一。大規(guī)模的流行病學(xué)研究提示，高尿酸血癥與心血管疾病的病程進(jìn)展密切相關(guān)。很多研究者傾向于認(rèn)為，UA可能是心血管疾病發(fā)生率和病死率獨(dú)立的特異性標(biāo)志物之一[2]。然而其相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。NLRP3炎性體作為固有免疫的重要組成部分，識(shí)別非微生物危險(xiǎn)信號(hào)并誘發(fā)無菌性炎性反應(yīng)參與心血管疾病等慢性炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。因此，筆者通過高濃度的UA體外處理HUVECs，探究可溶性高UA是否誘導(dǎo)HUVECs NLRP3炎性體通路來參與這一過程。

圖3 UA對(duì)HUVECs NLRP3炎性體啟動(dòng)無顯著影響A、B.200μg/ml的可溶性UA刺激HUVECs 24h或500ng/ml LPS處理12h后 Western blot法檢測(cè)NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表達(dá)量;C.用qPCR檢測(cè)NLRP3相應(yīng)mRNA水平;D.用qPCR檢測(cè)IL-1β相應(yīng)mRNA水平。數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn),*P<0.01

圖4 UA對(duì)HUVECs NF-κB無明顯刺激作用200μg/ml UA刺激HUVECs 24h或500ng/ml LPS處理12h后，共聚焦顯微鏡觀察NF-κB的表達(dá)和核移位情況(免疫熒光染色)

圖5 UA誘導(dǎo)HUVECs 內(nèi)NLRP3-ASC募集200μg/ml UA刺激HUVECs 24h或500ng/ml LPS處理12h+5mmol/L ATP處理30min后，共聚焦顯微鏡檢測(cè)NLRP3和ASC共定位情況(免疫熒光染色)

圖6 UA誘導(dǎo)HUVECs 產(chǎn)生ROSA.200μg/ml的可溶UA處理HUVEC 24h后，用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)胞質(zhì)ROS水平;B.通過ImageJ圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度。柱狀圖代表至少5個(gè)單獨(dú)視野中單個(gè)細(xì)胞總熒光強(qiáng)度(免疫熒光染色)

eNOS通過產(chǎn)生一氧化氮(NO)發(fā)揮舒血管作用，在內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中起標(biāo)志性重要作用[22]。eNOS的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及蛋白之間的相互作用均會(huì)影響NO的合成和釋放，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能。由于NLRP3炎性體啟動(dòng)過程需要NF-κB通路的參與，因此筆者用UA處理HUVECs之后熒光標(biāo)記NF-κB確定UA是否能激活NF-κB途徑[10]。ASC作為NLRP3通路的銜接分子，一旦與NLRP3產(chǎn)生復(fù)合體，募集下游的效應(yīng)器分子并最終切割pro-IL-1β形成有生物學(xué)活性的IL-1β。因此，NLRP3-ASC共定位可作為NLRP3炎性體活化的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，可溶性高UA誘導(dǎo)HUVECs上調(diào)黏附分子ICAM-1、E-選擇素和趨化分子CXCL10、CCL-26，提示UA誘導(dǎo)HUVECs活化。同時(shí)可溶性高UA下調(diào)HUVECs eNOS mRNA水平，提示UA在轉(zhuǎn)錄水平影響eNOS表達(dá)，從而可能影響HUVECs NO合成功能。

QPCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，可溶性高UA對(duì)NLRP3和pro-IL-1β mRNA和蛋白水平均無顯著影響，提示可溶性高UA并未激活HUVECs NLRP3炎性體的啟動(dòng)信號(hào)。雖然UA誘導(dǎo)HUVECs形成了NLRP3-ASC復(fù)合物，但可能由于NLRP3炎性體復(fù)合物形成較少且細(xì)胞內(nèi)沒有上調(diào)的pro-IL-1β，并未在細(xì)胞水平檢測(cè)到切割成熟的IL-1β。已有研究報(bào)道用LPS+UA的共刺激作用于小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞等檢測(cè)到IL-1β的釋放[15,23]。因此，UA與其他危險(xiǎn)因素如高脂、高糖等共同存在的條件下，UA與這些因子是否有協(xié)同作用激活NLRP3炎性體途徑并加劇內(nèi)皮細(xì)胞功能不良有待做深入研究。

本研究結(jié)果顯示，可溶性高UA未誘導(dǎo)HUVECs NF-κB活化。有多項(xiàng)研究報(bào)道，在人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，UA通過NF-κB通路誘導(dǎo)NLRP3炎性體啟動(dòng)，顯著上調(diào) NLRP3和pro-IL-1β，為NLRP3炎性體活化提供分子基礎(chǔ)[10]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，UA在HUVECs不通過激活NF-κB通路誘導(dǎo)NLRP3和pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)也觀察到UA誘導(dǎo)ROS在HUVECs內(nèi)累積。UA被認(rèn)為具有抗氧化性，但之后被報(bào)道UA的(抗)氧化能力取決于它所處的環(huán)境，UA在細(xì)胞外基質(zhì)和血漿中主要承擔(dān)抗氧化作用，一旦進(jìn)入細(xì)胞就發(fā)揮促氧化作用[1]。關(guān)于HUVECs的一項(xiàng)研究表明，高UA能正反饋進(jìn)入細(xì)胞中，并通過下調(diào)UA外流通道抑制UA流出，導(dǎo)致UA在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)大量積累并產(chǎn)生ROS[24]。另外，曾在單核細(xì)胞、人THP-1細(xì)胞等其他細(xì)胞系中多次被報(bào)道ROS可激活NLRP3炎性體[13]。但在本實(shí)驗(yàn)中，ROS對(duì)HUVECs 內(nèi)IL-1β的產(chǎn)生沒有顯著影響，提示ROS在HUVECs對(duì)NLRP3炎性體途徑的激活無直接刺激作用。

綜上所述，本研究首次用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞探討了UA對(duì)NLRP3炎性體通路的作用。結(jié)果顯示，可溶性高UA能使HUVECs活化。雖然UA促進(jìn)NLRP3-ASC復(fù)合體形成，但沒有誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生。雖然UA上調(diào)HUVECs ROS水平，但跟NLRP3通路的激活不直接相關(guān)。因此可溶性高UA不激活HUVECs NLRP3炎性體途徑從而影響HUVECs相關(guān)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，細(xì)胞內(nèi)NLRP3-ASC復(fù)合物顯著增加，因此不能排除UA在其他因素協(xié)同作用下誘導(dǎo)NLRP3炎性體的激活并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，從而參與心血管疾病等慢性炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展。