范 麗 姚亞妮 李 瑜

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指非肌型動脈肌層化，肺血管阻力進行性增高，進而引起右心力衰竭，導(dǎo)致患者死亡的心肺血管臨床綜合征[1，2]。凋亡是多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的細胞學(xué)基礎(chǔ)，近期研究表明，肺動脈平滑肌細胞凋亡的減少是引發(fā)PAH肺血管重塑的關(guān)鍵事件之一，可造成細胞過度堆積從而引發(fā)肺血管壁增厚，導(dǎo)致血管內(nèi)徑減小和阻力增加[3，4]。

二乙碳酰氨嗪(diethylcarbamazine，DEC)作為一種哌嗪衍生物，被廣泛應(yīng)用于治療淋巴絲蟲病，其作用機制尚未清楚。近年來多項研究報道DEC在多種肺部疾病模型中均表現(xiàn)出了優(yōu)秀的藥理活性，如嗜酸性粒細胞性肺炎、哮喘、卡拉膠急性肺損傷和急性肺炎等[5～8]。Queto等[6]研究指出，DEC通過CD95L/CD95信號通路抑制肺和骨髓中嗜酸性粒細胞的增多，實現(xiàn)對肺炎的保護作用。其中CD95L(FasL)是凋亡誘導(dǎo)受體CD95(Fas)的配體，該實驗表明DEC可以充當(dāng)細胞凋亡誘導(dǎo)劑的作用。本研究旨在通過評價DEC對PAH大鼠模型的肺組織及肺血管功能學(xué)、形態(tài)學(xué)以及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響，來探討DEC對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH的治療作用及其作用機制。

材料與方法

1.材料：(1)試劑：野百合堿購自美國Sigma公司?？笷ADD、caspase-8、Bax、Bcl-2和GAPDH等抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HRP-IgG購包美國Santa Cruz公司。抗α-SMA單克隆抗體購自美國Proteintech公司。生物素標(biāo)記的IgG二抗，ECL超敏發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。TUNEL試劑盒購自美國Roche公司。DAB顯色試劑購自索萊寶生物技術(shù)有限公司。(2)實驗動物：SPF級雄性Sprague Dawley大鼠30只，5周齡，體質(zhì)量220～250g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：65000700000045。動物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，自由攝食水，日關(guān)燈控制12h交替照明，室溫保持在21±2℃，濕度60%～80%，動物實驗過程嚴格遵照實驗動物護理和使用準則(The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)[9]。

2.動物分組及模型制備：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、DEC組。除正常組外的大鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，通過一次性腹腔注射60mg/kg野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓模型[10]。DEC組腹腔注射35mg/kg DEC，連續(xù)給藥28天，每天1次。正常組和模型組腹腔注射等體積0.9%的氯化鈉注射液。

3.RVSP、PAP的測定及RVHI的計算：各組大鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術(shù)臺，頸部消毒后縱向切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總靜脈，結(jié)扎血管遠心端。眼科剪切口，沿切口向右心室方向緩慢插入預(yù)充肝素0.9%氯化鈉注射液的聚乙烯導(dǎo)管，另一端連接生物換能器。Powerlab生物信息采集與處理系統(tǒng)已提前打開，并連接三通管和生物換能器監(jiān)護儀。緩緩向前推進導(dǎo)管，根據(jù)顯示的壓力值和壓力波形判斷導(dǎo)管所在位置。當(dāng)右心室壓力波形和肺動脈壓力波形出現(xiàn)時，固定導(dǎo)管位置，穩(wěn)定記錄10～15min后保存生物采集系統(tǒng)所捕獲的RVSP和PAP值。RVSP或PAP>25mmHg是公認的野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型成功建立的標(biāo)準。完成RVSP和PAP的檢測后，迅速暴露大鼠心臟，取出并用4℃ PBS沖洗干凈。沿著房室間溝剪去心房及大血管根部，經(jīng)肺動脈出口沿肺動脈圓錐和室間隔分離右心室游離壁，左心室加室間隔組織(left ventricle and interventricular septum，LV+S)兩部分。濾紙吸干表面多余的水分后稱量RV游離壁及LV+S的重量，兩者的比值即為右心室肥厚指數(shù)RVHI=RV/(LV+S)%。

4.HE染色、α-SMA免疫組織化學(xué)以及TUNEL染色：用HE染色法觀察各組肺血管重建情況[11]。取出大鼠左側(cè)肺葉，10%甲醛中固定48h后，蒸餾水沖洗10min。乙醇逐級脫水，浸蠟包埋并切片。切片行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察直徑50～200μm肺部細動脈病理改變并拍照，每只大鼠測定25支外觀相對圓整的血管。用Image-Pro Plus v6.0測量管腔的內(nèi)外徑，計算肺動脈血管壁的中膜厚度(medial wall thickness, MT)與外徑(external diameter, ED)的比值，即中膜厚度百分比作為肺血管重建的指標(biāo)，MT%=(2MT/ED)×100%。用α-SMA免疫組織化學(xué)染色法評估各組肺動脈肌化水平。肺組織常規(guī)石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟、抗原熱修復(fù)，3% H2O2室溫下孵育15min，α-SMA單克隆抗體(1∶50)4℃孵育過夜。用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫下孵育30min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。200×顯微鏡下可見200支左右血管，每只大鼠檢測25支直徑20～200μm的動脈并拍照。根據(jù)Jones等[12]評價方法，將血管分為完全肌化、部分肌化和無肌化3個等級，對各組3種肌化程度的血管數(shù)統(tǒng)計并分析。肺動脈壁中血管平滑肌細胞的凋亡情況采用原位細胞凋亡檢測試劑盒測定。組織的石蠟包埋和切片方法同HE染色和α-SMA免疫組織化學(xué)染色法，具體操作按照試劑盒說明進行。400×顯微鏡下觀察凋亡情況并拍照，用TUNEL陽性率來反映各組凋亡情況。

5.FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白表達水平的檢測：取肺組織100mg，加入裂解液冰上提取總蛋白。15000r/min離心10min獲得上清，BCA定量總蛋白濃度，蛋白煮沸以變性，置于-20℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h。加入FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2的單克隆抗體，4℃層析柜中孵育過夜。加入HRP-IgG二抗，室溫下振蕩孵育1h。滴加ECL顯色液，凝膠成像儀曝光，運用Image J獲得灰度值。

結(jié) 果

1.各組RVSP、PAP和RVHI的變化：與正常組比較，模型組RVSP、PAP和RVHI均明顯升高(P<0.05)。其中模型組的PAP或RVSP>25mmHg表明野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型成功建立，而RVHI的變化表明大鼠右心室出現(xiàn)肥厚。DEC組RVSP、PAP和RVHI均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明DEC顯著降低大鼠肺動脈壓力，緩解右心室肥厚(表1)。

表1 各組RVSP、PAP和RVHI的變化

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.HE染色、α-SMA免疫組化和TUNEL染色：正常組肺動脈內(nèi)表面光滑，管壁薄且管腔正常，幾乎無炎性細胞浸潤。模型組肺動脈內(nèi)皮細胞嚴重破壞，管壁明顯增厚伴隨管腔狹窄，炎性細胞大量浸潤。DEC組肺動脈內(nèi)皮細胞排列較整齊，管壁厚度較模型組明顯縮小，炎性細胞浸潤現(xiàn)象減輕(圖1A)。與對照組比較，模型組肺動脈MT%明顯增加，而DEC干預(yù)后肺小動脈MT%明顯下降(P<0.05，圖1B)。根據(jù)α-SMA免疫組化結(jié)果(圖1C)，按照α-SMA陽性分布率統(tǒng)計各組無肌化、部分肌化和完全肌化的肺動脈所占比例(圖1D)。與正常組比較，模型組中無肌化肺動脈所占比例顯著降低，而完全肌化比例顯著提高(P<0.05)。DEC組無肌化肺動脈所占比例顯著高于模型組，而完全肌化比例顯著低于模型組(P<0.05)。各組間部分肌化的肺動脈所占比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TUNEL染色檢測DEC對肺血管平滑肌細胞凋亡情況的影響(圖1E、F)。模型組中肺血管平滑肌細胞的TUNEL陽性率顯著低于正常組(P<0.05)，DEC組TUNEL陽性率顯著高于模型組(P<0.05)。

圖1 HE染色、α-SMA免疫組化和TUNEL染色A.HE染色(×200)；B.血管中膜厚度百分比(MT%)；C.α-SMA免疫組化(×200)；D.動脈肌化程度；E.TUNEL染色(×400)；F.TUNEL陽性率；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.肺組織中FADD、caspase-8、Bax、Bcl-2等蛋白的表達水平檢測：檢測肺組織中內(nèi)源性和外源性凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。與正常組比較，F(xiàn)ADD、caspase-8和Bax等凋亡蛋白在模型組中的表達水平顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著提高(P<0.05)。DEC組凋亡蛋白FADD、caspase-8和Bax的表達水平顯著高于模型組，Bcl-2的表達水平顯著低于模型組(P<0.05，圖2)。

圖2 FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白表達水平的變化A.蛋白免疫印跡；B.FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白表達水平；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

肺動脈高壓是指肺動脈內(nèi)膜增生和重構(gòu)引起的肺血管阻力進行性增加，最終導(dǎo)致右心負荷增加及右心功能不全的疾病[13]。MCT在大鼠體內(nèi)經(jīng)肝代謝轉(zhuǎn)換成吡咯野百合堿后作用于肺動脈管壁，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，肺血管平滑肌層增生，其誘導(dǎo)的PAH大鼠的病理改變與臨床動脈性肺高壓相似，是目前最常用的PAH模型[14]。本研究旨在評價DEC對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的保護作用，并探討其作用機制。

PAP和RVSP反映肺動脈壓力，是判斷肺動脈高壓模型是否建立成的客觀指標(biāo)[15]。高壓力負荷下的右心室功能決定了患者病情的嚴重程度和生存情況，RVHI反映右心功能，其代表的右心室肥厚程度是影響PAH預(yù)后的重要因素[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEC能有效降低MCT肺動脈高壓大鼠的RVSP、PAP和RVHI等指標(biāo)，說明DEC能改善MCT誘導(dǎo)的肺動脈壓力的上升和右心室肥厚的情況。

HE染色結(jié)果顯示，DEC能改善MCT誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞增生、肌層增厚和管腔狹窄等肺血管重構(gòu)的表現(xiàn)，有效降低炎性細胞浸潤。α-SMA是平滑肌表型的分子標(biāo)志物，由肺平滑肌細胞表達，其表達的上調(diào)反映肺動脈中膜層的增厚和肺動脈的肌化[17]。研究結(jié)果顯示，模型組α-SMA陽性率顯著高于正常組，說明PAH模型中肺動脈嚴重肌化。而DEC能夠明顯改善因為野百合堿誘導(dǎo)所提高的α-SMA陽性率，顯著降低PAH大鼠肺動脈中完全肌化的動脈比例，同時提高無肌化動脈所占比例，提示DEC能夠逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈肌化。為了探討DEC逆轉(zhuǎn)肺動脈壁重構(gòu)的作用機制，TUNEL法檢測各組肺動脈壁中動脈平滑肌細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，DEC組TUNEL陽性率顯著高于模型組，說明DEC能通過促進細胞凋亡發(fā)揮改善肺血管重構(gòu)作用。為了進一步探究其促凋亡分子機制，采用蛋白免疫印跡法檢測各組肺組織中FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白的表達水平。

細胞凋亡主要由兩條途徑觸發(fā)，分別是死亡受體途徑(外源性途徑)和線粒體通路(內(nèi)源性途徑)。外源途徑由外源性配體與其特定促凋亡受體結(jié)合而觸發(fā)，例如Fas結(jié)合FADD后活化caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，進而激活下游凋亡執(zhí)行蛋白caspase-1、caspase-3等[18,19]。內(nèi)源性途徑涉及線粒體應(yīng)激反應(yīng)，包括Bcl-2凋亡蛋白家族。Deng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1表達的下調(diào)會導(dǎo)致肺動脈高壓大鼠血栓的形成，出現(xiàn)Bcl-2的下調(diào)和Bad的上調(diào)。蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果表明，DEC能從外源途徑上顯著增加PAH大鼠中FADD、caspase-8的表達水平。DEC從內(nèi)源途徑上顯著下調(diào)了因MCT誘導(dǎo)而上升的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，顯著上調(diào)Bax表達。提示DEC能同時促進內(nèi)源性和外源性凋亡來減輕肺動脈平滑肌層增生。

綜上所述，DEC能同時作用于內(nèi)源和外源途徑凋亡分子標(biāo)志物，改善MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動脈壓力上升，右心室肥厚以及肺動脈重塑和肌化情況，希望能為臨床PAH的治療提供幫助。