史瑩?dān)L 朱 敏 葉恬恬 楊俊文 江魯紅 蔣麗元

1.杭州市丁橋醫(yī)院 杭州 310022 2.杭州市中醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院4.新疆維吾爾族自治區(qū)阿克蘇市人民醫(yī)院

梅尼埃病 （Meniere’s disease，MD）以發(fā)作性眩暈、聽力下降、耳鳴、耳悶脹感為典型臨床表現(xiàn)，是耳源性眩暈最常見的原因[1]。研究已經(jīng)證實，MD的病理基礎(chǔ)是內(nèi)耳膜迷路積水[2]。膜迷路積水的改善是緩解MD臨床癥狀的關(guān)鍵。臨床實踐表明，用電針治療MD具有較好療效，能改善前庭及內(nèi)耳功能，緩解眩暈、耳鳴癥狀[3]。筆者在前期研究中經(jīng)動物實驗證實，電針能顯著減輕耳源性眩暈豚鼠膜迷路積水，并且改善耳蝸聽功能[4]，與電針治療MD的臨床效果一致。

電針刺激頻率是影響電針療效的重要參數(shù)之一。目前關(guān)于電針治療MD刺激參數(shù)的研究較少，電針頻率的選擇尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報道，電針在鎮(zhèn)痛方面具有頻率依賴性[5]。研究已經(jīng)證實電針可減輕膜迷路積水，但關(guān)于電針對膜迷路積水的調(diào)節(jié)作用是否也存在頻率選擇性的問題，至今尚未見于報道，而且電針減輕膜迷路積水的機制目前也不明確。本研究在血管加壓素誘導(dǎo)的膜迷路積水模型上，以聽性腦干反射（auditory brainstem response，ABR）反應(yīng)閾值、耳蝸病理形態(tài)學(xué)為主要指標(biāo)，觀察不同頻率電針刺激“百會”“聽宮”穴對豚鼠膜迷路積水的改善作用，篩選出最佳電針頻率參數(shù)，并通過檢測耳蝸水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）的表達(dá)變化，初步探討電針治療MD的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 清潔級健康雄性白色紅目豚鼠48只，體質(zhì)量350～400g，耳廓Preyer反射靈敏，無眼震、無前庭功能異常表現(xiàn)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供并飼養(yǎng) [實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。實驗中對動物的所有處置均符合2006年國家科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)定。將豚鼠以完全隨機法分為空白組、模型組、假電針組、2Hz電針組、15Hz電針組和100Hz電針組，每組8只。

1.2試劑與儀器 醋酸去氨加壓素購于海南中和制藥股份有限公司（批號：20170701）；AQP2多克隆抗體購于Santa Cruz公司（批號：Y-B1-07C17B）；DAB顯色試劑盒購于武漢谷歌生物科技有限公司 （批號：20180419）。華佗牌無菌針灸針購于蘇州醫(yī)療用品有限公司（規(guī)格：0.30mm×13mm）；HANS-100A型韓式鎮(zhèn)痛電針儀為南京醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.3豚鼠膜迷路積水模型的建立與評價 除了空白組，其余各組參照文獻(xiàn)[6]采用腹腔注射醋酸去氨加壓素的方法建立膜迷路積水模型，先按4μg/（kg·d）劑量連續(xù)給藥7d，第8天將注射劑量加大為6μg/（kg·d），連續(xù)3d，共給藥10d。第11天起開始實施干預(yù)措施。豚鼠膜迷路積水模型的評價以耳蝸病理切片HE染色觀察結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.4干預(yù)方法 空白組常規(guī)飼養(yǎng)，不予治療，10d后觀察各項指標(biāo)。模型組造模完成后每日與各治療組動物采取相同固定方法及時間，不予其它治療，10d后觀察各項指標(biāo)。各電針組造模后開始行電針治療，以一次性不銹鋼毫針于“百會”穴向前平刺2mm，左側(cè)“聽宮”穴直刺3mm，接HANS-100A型韓式鎮(zhèn)痛電針儀，輸出電流1mA，留針20min，1次∕d，連續(xù)治療10d。2Hz電針組、15Hz電針組、100Hz電針組刺激頻率分別為2、15、100Hz。穴位選擇參照《實驗針灸學(xué)》[8]，于動物顱頂骨正中處選取“百會”穴，于側(cè)面部耳屏正前方凹陷處選取“聽宮”穴。假電針組予針刺“百會”穴和左側(cè)“聽宮”穴，但不通電，其余處理同電針組。各組每日于相同時間點進(jìn)行干預(yù)，取材當(dāng)日不行干預(yù)措施。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1ABR反應(yīng)閾值檢測 干預(yù)結(jié)束次日，以10%水合氯醛按300mg/kg的劑量腹腔注射麻醉豚鼠，采用聽覺腦干誘發(fā)電位儀對各組豚鼠進(jìn)行ABR反應(yīng)閾值檢測，評估實驗側(cè)耳聽力水平。

1.5.2組織學(xué)指標(biāo) 各組豚鼠麻醉狀態(tài)下快速開胸，充分暴露心臟，以4%多聚甲醛（pH=7.2）灌注，打開左側(cè)聽泡，分離顳骨，以4%多聚甲醛固定液固定過夜后，置于10%乙二胺四乙酸（pH=7.4）中，室溫下脫鈣約3周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。沿耳蝸蝸軸中央平面行4.5μm切片，再分別進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測。

1.5.2.1HE染色 切片常規(guī)脫蠟入水、烤片、梯度乙醇脫水，行HE染色、封片后，光鏡下觀察耳蝸形態(tài)，運用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)分別測量耳蝸中軸左右兩側(cè)第二轉(zhuǎn)蝸管橫截面積及前庭階橫截面積，并計算出比值（R值），R值=蝸管橫截面積/（蝸管橫截面積+前庭階橫截面積），耳蝸中軸兩側(cè)取平均值。

1.5.2.2免疫組化DAB染色 切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后滴加一抗，洗滌后再加入二步法免疫組化試劑，行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明后封片。光鏡下觀察AQP2表達(dá)情況，運用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析，檢測耳蝸中軸左右兩側(cè)第二轉(zhuǎn)外側(cè)壁AQP2的表達(dá)，對AQP2積分光密度（integrate optical density，IOD）值進(jìn)行測量，兩側(cè)取平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠ABR反應(yīng)閾值比較 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.646，P＞0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾值比較（±s，dB nHL）Tab.1 Comparison of ABR threshold in each group(±s，dB nHL)

表1 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾值比較（±s，dB nHL）Tab.1 Comparison of ABR threshold in each group(±s，dB nHL)

組別 豚鼠耳數(shù)（只） ABR反應(yīng)閾值空白組 8 8.75±3.54模型組 8 10.63±4.17假電針組 8 12.50±2.67 2Hz電針組 8 9.38±6.78 15Hz電針組 8 8.75±5.82 100Hz電針組 8 9.38±6.23

2.2各組豚鼠耳蝸R值及形態(tài)比較 各組R值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.770，P＜0.01）。與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸R值增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組豚鼠耳蝸R值均降低（P＜0.01，P＜0.05）；與假電針組比較，100Hz電針組R值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），2Hz電針組、15Hz電針組R值均較假電針組降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各電針治療組組間比較，100Hz電針組R值低于2Hz電針組、15Hz電針組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＜0.05）；而2Hz電針組、15Hz電針組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。見表2。

空白組均未出現(xiàn)膜迷路積水，前庭階、鼓階、蝸管結(jié)構(gòu)無異常；模型組出現(xiàn)膜迷路積水，表現(xiàn)為前庭膜向前庭階方向不同程度的隆起擴張；各電針組前庭膜隆起程度均較模型組不同程度減輕；100Hz電針組前庭膜隆起程度輕于2Hz電針組和15Hz電針組，2Hz電針組、15Hz電針組前庭膜隆起程度無明顯差異。見圖1。

表2 各組豚鼠耳蝸R值比較（±s）Tab.2 Comparison of R values of the cochlea in each group(±s)

表2 各組豚鼠耳蝸R值比較（±s）Tab.2 Comparison of R values of the cochlea in each group(±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與假電針組比較，##P＜0.01；與 2Hz電針組比較，▼P＜0.05；與 15Hz電針組比較，ΔP＜0.05Note：Compared with blank group，**P＜0.01;compared with model group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;compared with sham EA group，##P＜0.01;compared with 2Hz EA group，▼P＜0.05;compared with 15Hz EA group，ΔP＜0.05

組別 豚鼠耳數(shù)（只） R值空白組 8 0.29±0.04模型組 8 0.49±0.06**假電針組 8 0.42±0.06▲2Hz電針組 8 0.40±0.10▲15Hz電針組 8 0.39±0.07▲▲100Hz電針組 8 0.32±0.06▲▲##▼Δ

2.3各組豚鼠耳蝸AQP2表達(dá)比較 各組AQP2 IOD值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=5.239，P＜0.05）。與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸AQP2 IOD值增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組豚鼠耳蝸AQP2 IOD值均降低（P＜0.01，P＜0.05）；各治療組間比較，100Hz電針組AQP2 IOD值低于假電針組、2Hz電針組和15Hz電針組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖2。

3 討論

圖1 各組豚鼠耳蝸形態(tài)變化（HE染色，50×）Fig.1 Morphologic changes of the cochlea in each group(HE staining，50×)

表3 各組豚鼠耳蝸AQP2表達(dá)比較（±s）Tab.3 Comparison of AQP2 expression of the cochlea in each group(±s)

表3 各組豚鼠耳蝸AQP2表達(dá)比較（±s）Tab.3 Comparison of AQP2 expression of the cochlea in each group(±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01Note：Compared with blank group，**P＜0.01;compared with model group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 豚鼠耳數(shù)（只） IOD值空白組 8 6.70±1.23模型組 8 13.50±4.69**假電針組 8 7.19±1.92▲▲2Hz電針組 8 8.11±2.92▲▲15Hz電針組 8 9.54±4.74▲100Hz電針組 8 6.64±2.29▲▲

圖2 各組豚鼠耳蝸組織AQP2表達(dá)情況（DAB染色，100×）Fig.2 AQP2 expression of the cochlea in each group（DAB staining，100×）

中醫(yī)學(xué)并無“MD”病名，現(xiàn)多將MD引起的眩暈歸入“耳源性眩暈”。本虛標(biāo)實為MD眩暈的基本病機，因此臨床對該病的治療多以補益為主?！鹅`樞·海論》有“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴”的記載，故臨床治療眩暈首選與腦髓有關(guān)的穴位。百會歸屬督脈，別名“三陽五會”，為手足三陽、督脈之會，具有補益腦髓、平肝息風(fēng)、開竅止眩的功效，為治眩暈要穴。MD病位在耳，聽宮為手太陽小腸經(jīng)穴，位于耳廓前，手太陽小腸經(jīng)“卻入耳中”；聽宮又為手足少陽、手太陽之交會穴，內(nèi)通心、腦及肝膽之氣，針刺聽宮可疏利肝膽之氣，宣通耳竅，多用于內(nèi)耳疾病的治療。臨床上常以百會配伍聽宮，針灸治療內(nèi)耳眩暈癥[9]。本研究結(jié)果顯示，針刺“百會”“聽宮”穴能顯著減輕豚鼠膜迷路積水程度，與課題組前期研究結(jié)果相符[4，10]。

膜迷路積水導(dǎo)致的聽力變化多與前庭膜破裂后內(nèi)外淋巴液混合引發(fā)的耳蝸電生理改變有關(guān)。耳蝸電位是實現(xiàn)聽力功能的基礎(chǔ)。膜迷路積水時由于內(nèi)淋巴液容量急劇增加，引起前庭膜過度膨脹直至破裂，高K+、低Na+的內(nèi)淋巴液與高Na+、低K+的外淋巴液混合，內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境紊亂，引起耳蝸電位下降，電活動受抑制，導(dǎo)致聽力下降。同時，外淋巴液K+濃度迅速升高，使毛細(xì)胞發(fā)生持續(xù)去極化，電壓依賴性鈣通道持續(xù)開放，內(nèi)淋巴液及毛細(xì)胞發(fā)生鈣超載，同樣導(dǎo)致耳蝸電位下降，內(nèi)耳聽功能受損，最終出現(xiàn)聽力下降[11]。本研究中HE染色病理切片觀察證實，通過血管加壓素腹腔注射誘導(dǎo)的膜迷路積水動物模型并無前庭膜的破裂，可能是ABR反應(yīng)閾值未發(fā)生變化的原因之一。長時間血管加壓素處理后的膜迷路積水動物模型的ABR反應(yīng)閾值變化情況，尚未見于文獻(xiàn)報道，仍有待進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究。

研究證實，與耳部疾病相關(guān)的大腦區(qū)域存在著神經(jīng)元代謝異常的現(xiàn)象。李小圳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MD發(fā)作期與間歇期患者均存在靜息態(tài)雙側(cè)海馬區(qū)域功能連接差異，針刺穴位可激活有功能連接的多個腦區(qū)，從而發(fā)揮治療作用。動物實驗表明，電針刺激聽覺相關(guān)腧穴對經(jīng)絡(luò)有特異性激發(fā)作用，使聽皮層局部神經(jīng)細(xì)胞葡萄糖代謝水平增加，增強其生理活動[13]。電針的不同頻率是影響針刺效應(yīng)的關(guān)鍵因素。本次研究中，采用不同頻率電針干預(yù)膜迷路積水豚鼠，結(jié)果顯示假電針、2、15、100Hz電針均有良好的治療作用。各治療組間比較，100Hz電針療效最佳，提示高頻電針對豚鼠膜迷路積水的改善更為顯著。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高頻電針能夠治療神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病，因而在臨床上廣泛應(yīng)用[14]。高頻電針治療急性心肌梗死并發(fā)心力衰竭，能夠升高血壓，降低患者死亡率[15]；還可以調(diào)節(jié)缺血再灌注大鼠血管活性物質(zhì)含量[16]。研究還證實，高頻電針可以調(diào)節(jié)中樞和外周血清中神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽類物質(zhì)如γ-氨基丁酸、內(nèi)源性膽囊收縮素、星形膠質(zhì)細(xì)胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等的合成和分泌，從而起到鎮(zhèn)痛和神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[17-18]。而關(guān)于何種頻率的電針治療MD效果最佳，其具體機制如何，還鮮見于文獻(xiàn)報道。

目前認(rèn)為，膜迷路積水發(fā)生與內(nèi)耳水通道蛋白的表達(dá)及功能失調(diào)有關(guān)[19]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的13個水通道蛋白亞型中，AQP2在內(nèi)耳中的作用研究較為深入。AQP2是血管加壓素調(diào)節(jié)的靶蛋白，引起內(nèi)耳AQP2表達(dá)改變的調(diào)節(jié)方式與腎臟集合管相同，血管加壓素與內(nèi)耳血管加壓素受體2結(jié)合后，通過環(huán)磷酸腺苷介導(dǎo)的磷酸化作用引起AQP2表達(dá)增加及立體結(jié)構(gòu)改變，使水通道開放增加，內(nèi)淋巴液增多[20]。課題組前期研究結(jié)果表明，AQP2主要表達(dá)于耳蝸血管紋，注射血管加壓素可引起血管紋AQP2表達(dá)增加，針刺可下調(diào)血管紋處AQP2表達(dá)[21]。本研究結(jié)果表明，電針及假電針干預(yù)均可使模型組豚鼠耳蝸外側(cè)壁AQP2表達(dá)下調(diào)。電針刺激可能通過調(diào)控血管加壓素-AQP2系統(tǒng)，使耳蝸AQP2表達(dá)下調(diào)，水通道開放減少，抑制外淋巴液向內(nèi)淋巴液流動，從而減輕膜迷路積水。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同頻率的電針針刺“百會”“聽宮”穴均能減輕豚鼠膜迷路積水，其中100Hz電針效果最佳。電針治療減輕膜迷路積水的機制可能與下調(diào)耳蝸AQP2的表達(dá)有關(guān)。