任嬌艷 李宇娟 張 婷 梁 明 袁爾東*

（1 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510641 2 中新國(guó)際聯(lián)合研究機(jī)構(gòu) 廣州510000 3 無(wú)限極（中國(guó)）有限公司 廣州510665）

鰹魚(yú)，屬于深海洄游魚(yú)類，魚(yú)肉蛋白質(zhì)豐富，血脂含量低，氨基酸組成比例與人體肌肉蛋白相近，吸收利用度高，且鰹魚(yú)蛋白酶解物具有顯著的降尿酸活性和抗氧化活性[1-3]。研究表明，從鰹魚(yú)魚(yú)肉中鑒定合成的多肽DLDLRKDLYAN 具有顯著的氧自由基和ABTS 自由基清除能力[4]。據(jù)日本YSK 公司報(bào)道，從鰹魚(yú)蛋白中提取出兩種天然低聚肽--鵝肌肽和肌肽，發(fā)現(xiàn)其具有顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的功效。與大分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸相比，鰹魚(yú)蛋白酶解所得小分子多肽更容易被人體吸收利用[5]。酶解法制備多肽，生產(chǎn)條件溫和，易控制，產(chǎn)品安全性高，是工業(yè)制備活性多肽的常用方法。蛋白質(zhì)和多肽對(duì)溫度敏感，且均為兩親性物質(zhì)，其存在形式容易受溶液酸、堿度和溫度的影響。此外，酶活性和加酶量的變化易使酶解物中多肽鏈的結(jié)構(gòu)及氨基酸組成發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致多肽化學(xué)圖譜和化學(xué)活性的改變。酶解多肽的活性必需通過(guò)體外化學(xué)反應(yīng)才能檢測(cè)到，操作繁瑣，無(wú)法在工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)酶解產(chǎn)物的活性變化。研究多肽化學(xué)活性與其分子質(zhì)量圖譜、總氨基酸含量圖譜和質(zhì)譜間的相關(guān)性，對(duì)于明晰鰹魚(yú)蛋白活性肽“工藝-結(jié)構(gòu)表征-生物活性”三者間的關(guān)系具有重要的意義。

本試驗(yàn)在不同酶解工藝條件下制備鰹魚(yú)蛋白肽差異樣品，研究其蛋白質(zhì)回收率、分子質(zhì)量分布、總氨基酸含量與降尿酸活性、抗氧化活性之間的譜效關(guān)系；對(duì)鰹魚(yú)蛋白肽進(jìn)行分離純化和質(zhì)譜鑒定，探討鰹魚(yú)蛋白肽純化組分的降尿酸活性、抗氧化活性與質(zhì)譜分析圖譜間的相關(guān)性，旨在為活性肽工業(yè)化制備過(guò)程中的質(zhì)控提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰹魚(yú)，購(gòu)自山東；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、細(xì)胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6 511 u）、氧化型谷胱甘肽（651 u）、Gly-Gly-Gly（189 u），購(gòu)自sigma 公司；Trolox、Fluorescein、AAPH、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），購(gòu)自阿拉丁試劑公司；木瓜蛋白酶，購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

KDN-1 型自動(dòng)凱氏定氮儀，上海科曉科學(xué)儀器有限公司；Synergy H1 全功能微孔板檢測(cè)酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；A300 全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)曼默博爾公司；Akta 蛋白純化儀，美國(guó)通用電氣公司；高分辨高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，德國(guó)布魯克公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鰹魚(yú)蛋白肽樣品制備 將鰹魚(yú)魚(yú)糜與蒸餾水按料液質(zhì)量比1∶3 攪拌均勻，煮沸10 min 預(yù)處理滅酶，以鰹魚(yú)蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率為指標(biāo)，制備得到不同單因素條件下的差異樣品：

1）不同pH 條件 制備3 個(gè)pH （6.0，6.5，7.0）條件下, 加酶量（E/S）為1%木瓜蛋白酶，酶解溫度55 ℃酶解4 h 后，煮沸10 min 滅酶，于4 ℃，8 000 r/min 離心20 min 后過(guò)濾濃縮，-20 ℃冷藏備用。

2）不同溫度條件 根據(jù)蛋白質(zhì)回收率最高pH 7.0 條件，制備兩個(gè)溫度（50，60 ℃）條件下，1%木瓜蛋白酶酶解4 h 后煮沸10 min 滅酶，離心過(guò)濾濃縮后于-20 ℃冷藏備用。

3）不同加酶量條件 根據(jù)蛋白質(zhì)回收率最高pH 7.0，溫度55 ℃時(shí)，制備3 個(gè)加酶量（0.35%，0.50%，0.75%）條件的鰹魚(yú)蛋白肽樣品，-20 ℃冷藏備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定 鰹魚(yú)魚(yú)肉中蛋白質(zhì)為主要含氮物質(zhì)，故其蛋白質(zhì)回收率可通過(guò)氮回收率來(lái)表征。采用凱氏定氮法 （GB/T 5009.5-2003）測(cè)定鰹魚(yú)蛋白肽的總氮含量，依據(jù)以下計(jì)算方法確定其蛋白質(zhì)回收率：

蛋白質(zhì)回收率 （Nitrogen recovery ratio，%）=[酶解后上清液中的氮含量（g）/酶解前底物中的氮含量（g）]×100%

1.3.3 XOD 抑制活性的測(cè)定 XOD 是尿酸合成的關(guān)鍵酶，體外XOD 抑制活性可作為評(píng)價(jià)樣品降尿酸活性的有效方法[6-8]。在嘌呤代謝過(guò)程中，XOD可將黃嘌呤和次黃嘌呤氧化成尿酸，其反應(yīng)原理如下：

參照文獻(xiàn)[9]和[10]，并稍作修改。分別將50 μL 待測(cè)樣 品，50 μL 0.05 U/mL 的XOD 加入96酶標(biāo)儀檢測(cè)板中，37 ℃孵育10 min，加入150 μL 0.4 mmol/L 黃嘌呤溶液后，酶促反應(yīng)被啟動(dòng)，同時(shí)記錄2 min 內(nèi)反應(yīng)體系在290 nm 處吸光值的動(dòng)力學(xué)變化，以pH 7.5 PBS 緩沖液做參比，酶促反應(yīng)體系的初始反應(yīng)速率記為V0，樣品存在時(shí)酶促反應(yīng)體系的初始速率記為VS，按照以下公式計(jì)算樣品對(duì)XOD 活性的抑制率：

XOD 抑制活性 （XOD inhibitory activity，%）=（V0-VS）/V01.3.4 超氧陰離子（O2-）清除能力的測(cè)定 XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸的同時(shí)生成了超氧陰離子（O2-），O2-可與NBT 結(jié)合生成紫色甲瓚。參 照文獻(xiàn)[9-10]，并稍作修改。分別將50 μL 待測(cè)樣品，50 μL 0.05 U/mL 的XOD 加入96 酶標(biāo)儀檢測(cè)板中，37 ℃孵育10 min 后，加入150 μL 混合液（0.4 mmol/L 黃嘌呤+0.24 mol/L NBT），并記錄2 min內(nèi)反應(yīng)體系在290 nm 處的吸光值，以pH 7.4 PBS做空白對(duì)照，酶促反應(yīng)體系的初始反應(yīng)速率記為V0′，樣品存在時(shí)酶促反應(yīng)體系的初始速率記為VS′，按照以下公式計(jì)算樣品對(duì)O2-的清除能力：

O2-清除活性 （O2-Scavenging activity，%）=（V0′-VS′）/V0′

1.3.5 氧自由基清除能力 （ORAC）的測(cè)定 ORAC 方法是評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力，以維生素E 水溶性類似物Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，AAPH 為自由基引發(fā)劑，F(xiàn)luorescein 為熒光物質(zhì)，在485 nm 光激發(fā)下，可發(fā)射538 nm 的熒光。在水溶液中，AAPH 釋放過(guò)氧自由基將Fluorescein 氧化，熒光衰減?？寡趸瘎┩ㄟ^(guò)與過(guò)氧自由基結(jié)合，抑制其氧化Fluorescein，從而減緩熒光衰減的速度。

參照文獻(xiàn)[11]和[12]，并稍作修改。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，分別向96 酶標(biāo)儀檢測(cè)板中加 入20 μL 待 測(cè) 樣 品、Trolox（6.25，12.5，25，50 μmol/L）定量標(biāo)準(zhǔn)液和pH 7.4 PBS 緩沖液，37 ℃孵育10 min 后，加入200 μL Fluorescein 孵育20 min，其中對(duì)照組加入20 μL PBS 緩沖液，其余每孔加入20 μL AAPH，檢測(cè)2 h 內(nèi)反應(yīng)液在538 nm 處吸光值的變化。氧自由基清除能力ORAC 值是通過(guò)相對(duì)熒光衰減曲線面積S 的變化計(jì)算得出，公式如下：

物質(zhì)的量濃度/樣品物質(zhì)的量濃度

1.3.6 HPLC 分析鰹魚(yú)蛋白肽分子質(zhì)量分布 將標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞色素C、抑肽酶、氧化型谷胱甘肽和Gly-Gly-Gly 配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，鰹魚(yú)蛋白肽樣品稀釋成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的待測(cè)溶液，所有溶液均用0.22 μm 的微孔膜過(guò)濾后，采用AKTA 蛋白純化儀分離鰹魚(yú)蛋白肽，并分析其分子質(zhì)量分布范圍。蛋白純化洗脫條件為：色譜柱：Superdex peptide GL10/300；流動(dòng)相：0.02 mol/L PBS+0.25 mol/L NaCl （pH=7.2），流速：0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；樣品質(zhì)量濃度：5 mg/mL，進(jìn)樣量：500 μL。

1.3.7 鰹魚(yú)蛋白肽的總氨基酸含量分析 參照文獻(xiàn)方法[13]，并稍作修改。準(zhǔn)確吸取1 mL 樣品于水解管中，加入1∶1 分析純鹽酸5 mL，酒精噴燈封管后置烘箱中于110 ℃水解24 h，水解后的樣品冷卻至室溫，過(guò)濾到50 mL 容量瓶中定容，吸取2 mL 樣品置于60 ℃烘箱中脫酸至底部留有少許痕漬，再加入1 mL 樣品緩沖液混合均勻，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后備檢。采用全自動(dòng)氨基酸分析儀分析：色譜柱：membraPureT259 鈉離子交換柱；流動(dòng)相流速：160 μL/min；茚三酮溶液流速：80 μL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：脯氨酸在440 nm 處檢測(cè)，其余氨基酸均在570 nm 處檢測(cè)。

1.3.8 鰹魚(yú)蛋白肽的分離純化 DEAE-52 纖維素層析填料裝柱，以0.5 mL/min 流速先后用去離子水、0.05 mol/L NaCl、0.15 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl 溶液階段洗脫，收集洗脫組分并濃縮至一定濃度，測(cè)定其相應(yīng)的XOD 抑制活性和ORAC 值。鰹魚(yú)蛋白肽差異樣品經(jīng)DEAE-52 纖維素層析分離純化后，活性最好的組分進(jìn)一步采用Sephadex G15 純化，0.5 mL/min 流速，去離子水洗脫并收集各分離組分，濃縮至一定濃度后，測(cè)定其相應(yīng)的XOD 抑制活性和ORAC 值。

1.3.9 LC-MS/MS 鑒定純化組分的多肽序列 將組分B1、D1 和F1 配制成濃度為1 mg/mL 的待測(cè)溶液，進(jìn)一步進(jìn)行高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分析。參照文獻(xiàn)方法[14-15]，并稍作修改，洗脫條件為：Agilent 1290/maXis Impact，LC-Agilent Technologies 1290 Infinity 超高相液相色譜和MS-BRUKER maXis Impact 高分辨質(zhì)譜儀，C18 反相色譜柱：Agilent SB-C18，流動(dòng)相為乙腈梯度洗脫，1～4 min：20%～80% 乙腈水溶液；4～9 min：80%等度洗脫；9～10 min：80%～20%乙腈梯度洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件分析，質(zhì)譜結(jié)果采用Bruker Compass Data Analysis 4.1 軟件解譜，以P＜0.05 為顯著性評(píng)定指標(biāo)，數(shù)據(jù)用x±SD 表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graph prism 和origin 2017 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰹魚(yú)蛋白肽降尿酸活性及抗氧化活性評(píng)價(jià)

由圖1a 可知，酶解pH 和溫度變化時(shí)，鰹魚(yú)蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率隨pH 變化呈上升趨勢(shì)，鰹魚(yú)蛋白肽樣品S3 蛋白質(zhì)回收率最高，原因是木瓜蛋白酶對(duì)溫度和pH 敏感，在pH 7.0、溫度55 ℃時(shí)活性最高，其蛋白質(zhì)回收率最大。酶解加酶量增加時(shí)，木瓜蛋白酶酶解效率提高，從而使鰹魚(yú)蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率升高。

由圖1b 和圖1c 可知，當(dāng)酶解pH 升高時(shí)，差異樣品的XOD 抑制活性呈上升趨勢(shì)，其中S1 和S2 的ORAC 值 相 當(dāng)，S3 的XOD 抑 制 活 性 和ORAC 值均顯著高于S1 和S2（P＜0.05），說(shuō)明弱酸性或中性鰹魚(yú)蛋白肽的XOD 抑制活性和抗氧化活性更顯著；當(dāng)酶解溫度升高時(shí)，鰹魚(yú)蛋白肽的XOD 抑制活性和ORAC 值均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，溫度為55 ℃的鰹魚(yú)蛋白肽，其XOD 抑制活性和ORAC 值均顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明酶在最適溫度酶解效率提高，鰹魚(yú)蛋白肽中活性小分子多肽種類和數(shù)目明顯增多。當(dāng)增加木瓜蛋白酶的加酶量時(shí)，鰹魚(yú)蛋白肽的XOD 抑制活性和ORAC 值均呈先降低后上升的趨勢(shì)，加酶量為0.5%的S7 顯著低于加酶量為0.35%和0.75%的S6 和S8，原因是木瓜蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的酶解是非特異性的，S7 中可能含有較多活性較弱的多肽片段。

由圖2c 可知，鰹魚(yú)蛋白肽的XOD 抑制活性與ORAC 值二者顯著相關(guān)（P＜0.05），而氧自由基清除能力ORAC 值與樣品中羥基的存在有關(guān)[16]，說(shuō)明鰹魚(yú)蛋白肽的XOD 抑制活性可能與多肽分子中的羥基有關(guān)。由圖2a 和圖2b 可知，當(dāng)pH 條件變化時(shí)，XOD 抑制活性與蛋白質(zhì)回收率的變化具有相關(guān)性，蛋白質(zhì)回收率一定程度上能夠反映樣品的降尿酸活性。與此不同的是，在溫度和加酶量變化時(shí)，XOD 抑制活性和ORAC 值隨蛋白質(zhì)回收率的升高呈先降低后上升的趨勢(shì)，由于木瓜蛋白酶酶解的非特異性，加酶量及酶活性變化時(shí)，處于不同分子質(zhì)量段的多肽，其數(shù)目和種類都存在較大的差異性，從而導(dǎo)致活性之間的差異。

圖1 不同工藝制備鰹魚(yú)蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率（a）、XOD 抑制活性（b）和抗氧化能力ORAC 值（c）Fig.1 The nitrogen recovery ratio，XOD inhibitory activity and antioxidant activity of bonito protein hydrolysates

圖2 （a）蛋白質(zhì)回收率與XOD 抑制活性的相關(guān)性（b）蛋白質(zhì)回收率與ORAC 值的相關(guān)性和（c）XOD 抑制活性與ORAC 值的相關(guān)性Fig.2 （a）The correlation of nitrogen recovery ratio with XOD inhibitory activity，（b）the correlation of nitrogen recovery ratio with ORAC values and （c）the correlation of XOD inhibitory activity and ORAC values

2.2 鰹魚(yú)蛋白肽分子質(zhì)量分布與體外活性的相關(guān)性

由圖3a 中差異樣品的分子質(zhì)量分布可知，分子質(zhì)量＞1 ku 所占含量最高的為樣品S6，最低的為樣品S1。由圖3b 和圖3c 可知，差異樣品的活性與分子質(zhì)量＜1 ku 的含量之間并無(wú)直接的線性相關(guān)關(guān)系，S6 中存在較多酶解不完全且分子質(zhì)量較大的多肽，其XOD 抑制活性相對(duì)較高；當(dāng)分子質(zhì)量＜1 ku 的含量大于62.5%時(shí)，XOD 抑制活性在60%～70%和72.5%～82.5%范圍內(nèi)集中分布，ORAC 值在62.5%～73.5%和74%～85%范圍內(nèi)集中分布，說(shuō)明通過(guò)檢測(cè)多肽分子質(zhì)量＜1 ku 的含量在不同區(qū)段的分布，可初步了解樣品的XOD 抑制活性和ORAC 值水平。

圖3 （a）鰹魚(yú)蛋白肽分子質(zhì)量分布（b）分子質(zhì)量＜1 ku 的含量與XOD 抑制活性的相關(guān)性和（c）分子質(zhì)量＜1 ku 含量與ORAC 值的相關(guān)性Fig.3 The molecular weight （Mw）of bonito protein hydrolysates （a）, the correlation of the percentage of Mw ＜1 ku with XOD inhibitory activity （b）and ORAC values （c）

2.3 鰹魚(yú)蛋白肽總氨基酸含量與體外活性的相關(guān)性

由圖4a 和圖4b 可知，鰹魚(yú)蛋白肽樣品中總氨基酸含量的差異主要表現(xiàn)為脂肪族氨基酸含量的不同，說(shuō)明脂肪族氨基酸含量的變化是影響其活性差異的重要指標(biāo)。由圖4c 可知，脂肪族氨基酸含量與蛋白質(zhì)回收率的變化無(wú)線性相關(guān)性，而脂肪族氨基酸含量的變化與XOD 抑制活性和ORAC 值的變化趨勢(shì)基本呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明差異樣品的降尿酸活性和抗氧化活性可以通過(guò)脂肪族氨基酸含量的變化來(lái)評(píng)估其活性變化的可能趨勢(shì)。

圖4 鰹魚(yú)蛋白肽總氨基酸含量與體外活性的相關(guān)性Fig.4 Correlation between total amino acid content and in vitro activity of bonito protein peptide

2.4 鰹魚(yú)蛋白肽的分離純化及活性評(píng)價(jià)

差異樣品S1-S8 經(jīng)DEAE-52 纖維素層析純化后，發(fā)現(xiàn)去離子水洗脫組分的XOD 抑制活性和ORAC 值均顯著高于其它溶液洗脫組分，故將去離子水組分進(jìn)一步用Sephadex G15 分離純化，純化后組分分別記為A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1 和H1。純化組分的ORAC 值、XOD 抑制活性、O2-清除活性及30 min 時(shí)290 nm 處尿酸吸收值測(cè)定結(jié)果如圖5所示。

由圖5a 可知，分離純化后的組分A1-H1，除組分E1 的ORAC 值降低之外，其余樣品的ORAC值均顯著升高，說(shuō)明大部分樣品在純化過(guò)程中氧自由基清除能力較強(qiáng)的多肽得到富集。

由圖5b 和圖5c 可知，酶促反應(yīng)在30 min 達(dá)到反應(yīng)平衡后，純化組分均具有顯著的降低尿酸含量的功效。然而，純化組分對(duì)黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成尿酸初始速度的相對(duì)抑制率評(píng)價(jià)其XOD 抑制活性時(shí)，組分A1、B1、C1、E1 和G1 均表現(xiàn)為促進(jìn)酶促反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)測(cè)定其反應(yīng)體系O2-的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些組分具有較強(qiáng)的O2-清除活性，說(shuō)明樣品在逐級(jí)純化過(guò)程中，活性多肽富集，當(dāng)組分中抗氧化肽的有效分子數(shù)目明顯高于降尿酸肽的有效分子數(shù)目時(shí)，抗氧化活性成為純化組分發(fā)揮功效的主導(dǎo)，從而使酶促反應(yīng)向生成產(chǎn)物方向進(jìn)行，導(dǎo)致反應(yīng)初始階段呈現(xiàn)出尿酸生成速率加快的現(xiàn)象。與此不同的是，組分D1、F1 和H1在反應(yīng)初始階段便具有較強(qiáng)的O2-清除活性和XOD 抑制活性，在反應(yīng)平衡后F1 和H1 的尿酸水平顯著降低，而D1 的尿酸吸光值降低不明顯，說(shuō)明抗氧化肽加速反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)并不改變反應(yīng)平衡時(shí)降尿酸肽的XOD 抑制活性。這與上述分子質(zhì)量分布圖譜及總氨基酸含量的分析結(jié)果一致，不同活性肽在差異樣品中分子數(shù)目所占含量，使其分子質(zhì)量分布圖譜、總氨基酸含量及體外化學(xué)活性改變，但樣品的降尿酸活性和抗氧化活性主要取決于組分中多肽的氨基酸序列。

圖5 鰹魚(yú)蛋白肽的分離純化及活性評(píng)價(jià)Fig.5 Purification and activity evaluation of bonito protein peptide

2.5 鰹魚(yú)蛋白肽的結(jié)構(gòu)鑒定與體外活性的相關(guān)性

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步了解鰹魚(yú)蛋白肽質(zhì)譜圖譜、氨基酸序列變化與其降尿酸活性、抗氧化活性之間的相關(guān)性，篩選差異樣品純化組分中XOD 抑制活性較強(qiáng)的B1 和F1 與活性較弱的D1，分析其LC-MS/MS 質(zhì)譜圖譜及氨基酸序列。

由圖6可知，組分B1 和D1 在1～4 min 內(nèi)基峰圖的峰形相似，其中B1 的信號(hào)明顯高于D1，且具有3 個(gè)明顯的峰形。在0～1 min 時(shí)，B1 和F1 均具有一個(gè)較強(qiáng)信號(hào)峰，組分F1 在1～3 min 內(nèi)信號(hào)較弱，在3～5 min 時(shí)信號(hào)較強(qiáng)，峰形明顯，基本為高濃度乙腈溶液洗脫出的疏水性多肽。

圖6 純化組分B1、D1、F1 的BPC 圖Fig.6 The basic peak chromatogram （BPC）of the purified fractions B1，D1 and F1

由表1可知，經(jīng)過(guò)DEAE-52 纖維素層析和Sephadex G15 分離純化后，組分F1 中多肽片段相對(duì)較純，WML 為疏水性多肽，組分B1 中LEYE、LPVI 和LPVPAF 為疏水性多肽，組分F1中LEYE 為疏水性多肽，其余多肽序列均為親水性多肽，其中親水性多肽AMPF 同時(shí)存在于組分B1 和F1 中，疏水性多肽LEYE 同時(shí)存在于組分D1 和F1 中。色氨酸及含有色氨酸的多肽已被證明具有顯著的XOD 抑制活性[17]，疏水肽WML 可能具有XOD 抑制活性。因此，結(jié)合圖6純化組分的基峰圖與圖5組分的活性分析結(jié)果，說(shuō)明B1 和D1 的抗氧化活性可能與1～3 min 內(nèi)信號(hào)強(qiáng)的多肽片段相關(guān)，而B(niǎo)1 和F1 的XOD 抑制活性可能是由0～1 min 內(nèi)親水性多肽和3～5 min 內(nèi)疏水性多肽共同作用的結(jié)果，故1～3 min 內(nèi)信號(hào)最強(qiáng)的B1具有顯著的抗氧化活性，在XOD 活性測(cè)定時(shí)表現(xiàn)為加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行，使其反應(yīng)初始速率上升，而F1 在1～3 min 內(nèi)信號(hào)弱，故其抗氧化活性相對(duì)較低。

表1 組分B1、D1 和F1 鑒定出的多肽序列Table 1 The amino acid sequence of peptides identified from B1，D1 and F1

3 結(jié)論

不同工藝條件制備的鰹魚(yú)蛋白肽差異樣品，其XOD 抑制活性與氧自由基清除能力ORAC 值之間具有顯著的相關(guān)性。單因素pH 條件改變時(shí)，蛋白質(zhì)回收率的變化與鰹魚(yú)蛋白肽活性的變化趨勢(shì)一致。鰹魚(yú)蛋白肽的XOD 抑制活性和ORAC 值在多肽分子質(zhì)量＜1 ku 所含占比的不同分布區(qū)段集中，且與脂肪族氨基酸的含量呈相反的趨勢(shì)變化，從而可通過(guò)分子質(zhì)量分布和脂肪族氨基酸含量的變化對(duì)其化學(xué)活性進(jìn)行初步評(píng)估。分離純化和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明，純化組分質(zhì)譜基峰圖在0～1 min、1～3 min 和3～5 min 峰形分布可能與降尿酸肽和抗氧化肽在鰹魚(yú)蛋白中的分布顯著相關(guān)。因此，通過(guò)分析樣品的分子質(zhì)量分布圖譜、脂肪族氨基酸含量圖譜及純化后質(zhì)譜基峰圖圖譜，可進(jìn)一步對(duì)鰹魚(yú)蛋白降尿酸肽和抗氧化肽的制備工藝進(jìn)行質(zhì)控。