谷懿寰 彭倩楠 姜帥銘 馬臣臣 霍冬雪

（海南大學(xué)食品學(xué)院 ?？?70228）

發(fā)酵蔬菜是以新鮮蔬菜為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵形成的傳統(tǒng)風(fēng)味食品[1]，其風(fēng)味物質(zhì)主要通過蔬菜原輔料、微生物發(fā)酵、生理生化和酶促反應(yīng)3 個途徑形成[2-3]。我國發(fā)酵蔬菜主要采用自然發(fā)酵方式，借助天然附著于蔬菜表面的多種微生物進(jìn)行腌制[4-5]，其中起主導(dǎo)作用的是乳酸菌群，是形成發(fā)酵蔬菜獨特風(fēng)味的主要微生物，發(fā)酵的產(chǎn)品具有酸咸味正、微辣微甜、醇香可口的獨特風(fēng)味[6]。研究表明發(fā)酵蔬菜具有凈腸、預(yù)防腸炎、抗動脈硬化、抗老化和抗癌等多種功能[7-8]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對多種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中的微生物多樣性進(jìn)行了研究。王磊等[9]對東北家庭自制酸菜進(jìn)行研究，經(jīng)16S r DNA 序列分析鑒定出40 種乳酸菌，主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、混淆魏斯氏菌（Weissella confuse）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、食物魏斯氏菌（Weissella cibaria）。李雪萍[10]對采集自甘肅省慶陽市環(huán)縣的西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜漿水進(jìn)行研究，確定乳桿菌為其發(fā)酵過程中主要菌屬之一。田偉[11]通過16S rRNA 基因序列分析，確定四川傳統(tǒng)泡菜樣品中戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳桿菌和有害片球菌（Pediococcus damnosus）是優(yōu)勢菌種。侯強(qiáng)川等[12]通過純培養(yǎng)的方法結(jié)合16S rRNA 測序技術(shù)對采集自俄羅斯卡爾梅克共和國埃利斯塔市郊的2 份發(fā)酵蔬菜樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明乳桿菌和乳球菌（Lactococcus）是其中的優(yōu)勢菌屬。Chao 等[13]從臺灣客家部落傳統(tǒng)酸菜和福菜中分離得到的微生物屬于腸球菌、乳桿菌、明串珠菌、片球菌和魏斯氏菌（Weissella）。Myungjin 等[14]采用16S rRNA 基因克隆文庫的方法對5 種韓國泡菜的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中大部分屬于乳酸菌。

海南省地理位置獨特，氣候條件優(yōu)越，擁有豐富的微生物資源，是我國發(fā)展熱帶生物產(chǎn)業(yè)和研究熱帶微生物資源的重要區(qū)域[15]。海南發(fā)酵蔬菜以家庭式天然發(fā)酵為主，保留了許多當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益微生物，是研究海南微生物多樣性的極佳模型。本研究結(jié)合純培養(yǎng)技術(shù)和16S rRNA基因序列分析，對采自海南省不同地區(qū)的發(fā)酵蔬菜樣品進(jìn)行微生物多樣性分析，旨在發(fā)掘海南地區(qū)的熱帶微生物資源，并為其開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從海南白沙、昌江、臨高、瓊中、文昌、萬寧和五指山7 個地區(qū)采集的30 份家庭自制發(fā)酵蔬菜樣品，種類包括竹筍、小西瓜、白菜和豆角。

1.1.2 主要試劑 MRS 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；M17 培養(yǎng)基，英國OXOID 公司；6×DNA loading buffer，2×Es Taq Master Mix，D2000 DNA ladder，蛋白酶K，均購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Green 2×Buffer，寶生物工程（大連）有限公司；Goldview，美國AMERCO 公司；Agarose LE，天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 設(shè)備與儀器 SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；生化培養(yǎng)箱，電熱鼓風(fēng)干燥器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；85-1 恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；臺式冷凍離心機(jī)，SORVALL；熒光定量PCR 儀，Bio-Red 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 發(fā)酵蔬菜的種類及采集地見表1。

將發(fā)酵蔬菜樣品編號，裝入無菌采樣器，在全程4 ℃低溫條件下運輸至實驗室。每份發(fā)酵蔬菜樣品各稱取10 g 與90 mL 無菌生理鹽水混合均勻，10 倍梯度稀釋，制成10-1～10-5的稀釋液。

表1 發(fā)酵蔬菜樣品的種類及采集地Table 1 Types and collecting sites of fermented vegetable samples

1.2.2 微生物分離與純化 從稀釋倍數(shù)為10-3～10-5的稀釋液中各吸取100 μL，涂布于M17 和MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂布1 個平板。置于無氧條件37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后觀察菌落形態(tài)并記錄，挑選疑似菌落接種到肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后，革蘭氏染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，檢驗是否為純種。檢驗為純種的菌株，傳代后用含有0.1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳于-80 ℃條件下保藏。

1.2.3 16 S rRNA 基因序列分析 液氮凍融法提取菌株總基因組DNA，參考文獻(xiàn)[16-18]中的CTAB 法并做修改，DNA 于-20 ℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。16S rRNA 擴(kuò)增引物：正向通用 引 物A27F （5′-AGCGGATCACTTCACACAG GACTACGGCTACCTTGTTACG-3′）和反向通用引物A1495R （5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAA GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Es Taq Master Mix 25 μL，引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，DNA 模板（100 ng/μL）1.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，1 min；退火55 ℃，1 min；延伸72℃，2 min，循環(huán)30 次；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保溫。

PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰且無明顯非特異性擴(kuò)增即PCR 成功。測序工作由上海派諾森生物科技有限公司完成。

1.2.4 qPCR 分析 采用液氮凍融法提取發(fā)酵蔬菜中微生物宏基因組DNA，結(jié)合分離鑒定結(jié)果并參照文獻(xiàn)[19]合成乳桿菌、片球菌和腸球菌屬特異性引物，qPCR 引物見表2，通過擴(kuò)增上述菌屬的對照菌株構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋后與樣品一起進(jìn)行qPCR 并計算樣品中目的菌屬的基因拷貝數(shù)。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Green 2×Buffer 10 μL（10 μmol/L），DNA 模板2 μL，引物各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL，3 個重復(fù)。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃30 s；94 ℃5 s；在其各自的退火溫度下退火40 s；72 ℃50 s，循環(huán)40 次。熔融曲線溫度65～95 ℃。qPCR 工作由上海派諾森生物科技有限公司完成。

表2 qPCR 引物Table 2 Primers for qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離與純化

經(jīng)分離純化從樣品中分離出172 株菌株。

2.2 16S rRNA 序列同源分析鑒定

使用SeqMan 對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，手動修正錯誤，序列約長1 500 bp。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 分析，選擇準(zhǔn)確率和覆蓋率在98%及以上的作為鑒定結(jié)果。16S rRNA 基因序列同源分析共鑒定出乳桿菌（145 株）、腸球菌（26 株）、片球菌（1株）三大類菌屬，其中乳桿菌屬數(shù)量最多，占菌屬總數(shù)的84.30%。在白沙、昌江、臨高、瓊中、文昌和五指山6 個地區(qū)的樣品中均發(fā)現(xiàn)大量植物乳桿菌（65 株），可見植物乳桿菌是海南發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢菌種。另外還鑒定出其它12 種乳桿菌，酸面團(tuán)乳桿菌（Lactobacillus zymae）1 株、葡萄酒乳桿菌（Lactobacillus vini）2 株、青貯飼料乳桿菌（Lactobacillus silagei）2 株、深圳乳桿菌（Lactobacillus shenzhenensis）2 株、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）2 株、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）2株、那慕爾乳桿菌（Lactobacillus namurensis）6 株、納格爾氏乳桿菌（Lactobacillus nagelii）1 株、福菜乳桿菌 （Lactobacillus futsaii）1 株、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）54 株、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）1 株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）6 株。腸球菌屬占總體的15.12%，鑒定出兩類菌種，屎腸球菌（Enterococcus faecium）24株和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）2 株。研究還發(fā)現(xiàn)少量的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）1 株。

2.3 不同地區(qū)發(fā)酵蔬菜微生物多樣性對比

由表3可看出，7 個地區(qū)的發(fā)酵蔬菜樣品在菌種種類和數(shù)量上存在一定差異。由圖1可更直觀看出生物多樣性的差異。

表3 不同地區(qū)發(fā)酵蔬菜樣品16S rRNA 序列同源分析鑒定結(jié)果Table 3 Identification of isolates based on 16S rRNA sequencing of fermented vegetable samples from different regions

（續(xù)表3）

圖1 不同地區(qū)發(fā)酵蔬菜微生物多樣性對比Fig.1 Comparison of microbial diversity in fermented vegetables from different areas

五指山地區(qū)樣品中分離鑒定出的微生物種類最多，共6 個菌種，31 株菌，占總數(shù)的18.02%。瓊中地區(qū)樣品中分離鑒定出的微生物數(shù)量最多，共38 株菌，占總數(shù)的22.09%，屬5 個菌種。文昌地區(qū)樣品中分離鑒定出的微生物種類和數(shù)量均最少，共4 個菌種，7 株菌，占總數(shù)的4.07%。

瓊中地區(qū)特有的菌種為戊糖片球菌。文昌地區(qū)特有3 個菌種分別為酸面團(tuán)乳桿菌、葡萄酒乳桿菌、納格爾氏乳桿菌。萬寧地區(qū)特有的2 個菌種分別為福菜乳桿菌、糞腸球菌。五指山地區(qū)特有的3 個菌種分別為青貯飼料乳桿菌、深圳乳桿菌、棒狀乳桿菌。

2.4 不同種類發(fā)酵蔬菜微生物多樣性對比

由表4可知，4 種蔬菜種類的發(fā)酵蔬菜樣品在菌種種類和數(shù)量上存在一定差異，由圖2可直接觀看出不同蔬菜種類微生物多樣性的差異。

發(fā)酵豆角樣品中菌株數(shù)量最多，共分離鑒定出56 株菌，9 個菌種，占總數(shù)的32.65%。發(fā)酵白菜樣品中分離鑒定出的微生物種類最多，但從中分離鑒定出的微生物數(shù)量最少，共11 個菌種，29 株菌，占總數(shù)的16.86%。發(fā)酵小西瓜樣品中分離鑒定出的微生物種類最少，共4 個菌種，40 株菌，占總數(shù)的23.26%。

在發(fā)酵竹筍、發(fā)酵小西瓜、發(fā)酵豆角、發(fā)酵白菜樣品中均發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌、屎腸球菌。發(fā)酵豆角中特有的5 個菌種為青貯飼料乳桿菌、深圳乳桿菌、棒狀乳桿菌、福菜乳桿菌、戊糖片球菌。發(fā)酵白菜中特有的5 個菌種為酸面團(tuán)乳桿菌、葡萄酒乳桿菌、那慕爾乳桿菌、納格爾氏乳桿菌、糞腸球菌。

表4 不同種類發(fā)酵蔬菜樣品16S rRNA 序列同源分析鑒定結(jié)果Table 4 16S rRNA sequence homology analysis results of different kinds of fermented vegetable samples

圖2 不同種類發(fā)酵蔬菜微生物多樣性對比Fig.2 Comparison of microbial diversity in fermented vegetables from different kinds

2.5 qPCR 定量優(yōu)勢微生物

基于菌屬特異性引物，通過實時熒光定量PCR 技術(shù)，對發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢微生物進(jìn)行定量研究。因測定均為單基因拷貝數(shù)，故可代表其含量。各個發(fā)酵蔬菜樣品中乳桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬的含量如表5所示。

表5 各菌屬含量Table 5 Content of bacteria

研究結(jié)果表明在每份海南發(fā)酵蔬菜樣品中乳桿菌的平均含量5.22×107CFU/g，片球菌的平均含量為9.42×105CFU/g，腸球菌的平均含量為1.07×104CFU/g。由表5可知，在白沙、昌江、臨高、瓊中、文昌、萬寧、五指山7 個地區(qū)的發(fā)酵蔬菜樣品中乳桿菌含量均為最高，腸球菌的含量均為最低，且各地區(qū)的乳桿菌的含量均明顯高于片球菌和腸球菌的含量。在不同的發(fā)酵蔬菜樣品中乳桿菌含量均為最高，腸球菌的含量均為最低，且乳桿菌含量均明顯高于片球菌的含量和腸球菌的含量。

由表6可知，瓊中地區(qū)的樣品中乳桿菌的平均含量最多，白沙地區(qū)的樣品中乳桿菌的平均含量最少。昌江地區(qū)的樣品中片球菌的平均含量最多，臨高地區(qū)的樣品中片球菌的平均含量最少。白沙地區(qū)的樣品中腸球菌的平均含量最多，昌江地區(qū)樣品中腸球菌的平均含量最少。

表6 不同地區(qū)樣品中菌屬的平均含量Table 6 The average content of bacteria in different areas

由表7可知，發(fā)酵豆角中乳桿菌的平均含量最多，發(fā)酵小西瓜中乳桿菌的平均含量最少。發(fā)酵竹筍中片球菌的平均含量最多，發(fā)酵白菜中片球菌的平均含量最少。發(fā)酵豆角中腸球菌的平均含量最多，略高于發(fā)酵竹筍，發(fā)酵白菜中腸球菌的平均含量最少。

表7 不同種類樣品中菌屬平均含量Table 7 The average content of bacteria in different kinds of samples

3 討論

本研究通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法、16S rRNA 基因序列分析和熒光定量PCR 技術(shù)對樣品中的微生物進(jìn)行多樣性分析。通過分離鑒定，共獲得了172 株乳酸菌，其中乳桿菌屬是海南發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢菌屬，植物乳桿菌是海南發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢菌種。根據(jù)叢敏等[20]對以白菜為主要原料的東北酸菜的研究，植物乳桿菌為其發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種；根據(jù)陳功等[21]對四川泡菜的研究，植物乳桿菌是其發(fā)酵優(yōu)勢菌種之一，本研究結(jié)果與之前的結(jié)果相符。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)采集的發(fā)酵蔬菜中微生物多樣性存在差異，采集自五指山地區(qū)的發(fā)酵蔬菜微生物多樣性最為豐富；不同種類的發(fā)酵蔬菜中微生物多樣性也存在差異，發(fā)酵白菜中微生物多樣性最為豐富。根據(jù)之前的研究[22-24]，發(fā)酵食品中微生物的數(shù)量與種類與其發(fā)酵條件有密切關(guān)系。本研究所采集的發(fā)酵蔬菜，其自然環(huán)境存在差異，原料種類不同，制作方法保留當(dāng)?shù)靥攸c，發(fā)酵的周期、溫度、酸度等因素都可能導(dǎo)致從不同發(fā)酵蔬菜樣品中分離鑒定出的微生物種類及優(yōu)勢菌群不同。

本研究結(jié)果揭示了海南傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的多樣性，分離并保存了有益菌株，如植物乳桿菌，研究表明其具有降低血清中膽固醇濃度、抑制腸道病原菌增殖、降低食品中亞硝酸鹽濃度等益生作用[25]，為后續(xù)海南地區(qū)有益微生物的開發(fā)利用和發(fā)酵蔬菜的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。