祝愛艷 梁 露 侯金雪 孫雪楓 楊延峰 王遠興

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

贛南臍橙是指產(chǎn)于江西贛州的臍橙。近幾年來，贛南已成為全世界種植面積最大，年產(chǎn)量世界第三、全國第一的臍橙產(chǎn)區(qū)[1]。贛南臍橙因色澤鮮艷、風(fēng)味濃甜芳香、口感酸甜適度而深受廣大消費者的歡迎和喜愛[2]。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)中繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后又一重要分支，是研究生物體受病理生理刺激或基因改變而引起的體內(nèi)代謝物動態(tài)變化的一門新學(xué)科[3]。核磁共振（NMR）技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)等常用于代謝組學(xué)研究[4-8]，并通過化學(xué)計量學(xué)分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘分析（OPLS-DA）進行數(shù)據(jù)分析。代謝組學(xué)已被應(yīng)用醫(yī)學(xué)、植物和微生物等領(lǐng)域[9-14]。目前國內(nèi)代謝物組學(xué)的研究大多為代謝指紋圖譜（metabolite fingerprinting），代謝指紋圖譜是對所有代謝物進行高通量的代謝分析，是一種非靶點的方法。非靶點[15]代謝組學(xué)全面檢測生物體整個代謝，重點尋找不同環(huán)境下植物樣品中有顯著變化的代謝特征，并鑒定代謝特征的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進而解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物及其代謝通路與生命過程或生命狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。Parastar H 等[16]采集了4 種柑桔屬植物（檸檬、橙、柑桔、葡萄柚）的18 個批次樣本，并采用多種化學(xué)計量學(xué)方法對其果實皮的次級代謝產(chǎn)物進行GC-MS 指紋性分析，結(jié)果表明代謝組學(xué)方法可以用于柑桔類植物的辨別。Díaz R 等[17]利用超高效液相-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對柑橘產(chǎn)地溯源進行研究，結(jié)果表明，通過多元統(tǒng)計學(xué)分析得到重要的標志物為枸櫞苦素D，可以區(qū)分瓦倫西亞和其它外國的柑橘。

目前，有關(guān)贛南臍橙揮發(fā)性成分有一定的報道[18-19]，主要是臍橙果皮、果肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，未見對其產(chǎn)地溯源的分析報道。唐會周等[20]采購市售5 種臍橙，利用其揮發(fā)性成分進行主成分分析，結(jié)果表明，不同臍橙的香氣成分有所差異。該研究未對其影響差異的成分進行分析。近年來，我國的臍橙栽培面積不斷擴大，市場上贛南臍橙因受到其它產(chǎn)區(qū)的偽冒果品的影響，使消費者對其質(zhì)量和信心大大降低，建立相關(guān)的評價方法鑒別真?zhèn)慰杀ＷC贛南臍橙的品質(zhì)并提高其市場競爭力。

本試驗中采用GC-MS 分析臍橙的揮發(fā)性物質(zhì)，通過代謝組學(xué)分析方法比較贛南臍橙和其它地區(qū)臍橙的差異性，找尋臍橙的潛在生物標志物，區(qū)分贛南臍橙和其它地區(qū)的臍橙，以期完善贛南臍橙質(zhì)量評價體系，樹立贛南臍橙的品牌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

贛南臍橙采摘于贛南信豐、尋烏、安遠和瑞金等地，非贛南臍橙采摘于新寧、秭歸等地。所有贛南臍橙和非贛南臍橙均新鮮無病蟲害，每個地區(qū)在不同地方采集6 個點，試樣均采于同年同月。每組樣品選取6 個大小均勻、無損傷的去皮去核臍橙，將其可食部分打碎混勻，用于試驗分析。

1.2 儀器與設(shè)備

AL 104 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；7890-7000GC-QQQ-MS 氣相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有MassHunter Workstation 色譜工作站和NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫），美國Agilent 公司；DKS-24 不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；料理機，九陽有限公司；57330-U SPME 手柄，美國SUPELCO 公司；50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS，Stable flex）固相微萃取纖維頭，美國SUPELCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 分別精確稱取3.00 g 贛南臍橙和非贛南臍橙果肉勻漿于20 mL 頂空萃取瓶中，立即用聚四氟乙烯隔墊蓋子密封；將頂空萃取瓶置于50 ℃水浴鍋中水浴平衡30 min；再將固相萃取頭插入頂空萃取瓶中，萃取吸附30 min。萃取后將萃取頭放入GC-MS 進樣口中，250 ℃解析5 min。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：HP-5 MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：起始柱溫35℃，保持5 min，以6 ℃/min 升至60 ℃，保持1 min，然后以3 ℃/min 升至140 ℃，保持1 min；再以7 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min；載氣：高純氦氣 （純度≥99.999%）；流速1 mL/min；進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃；分流比5∶1。

1.3.3 質(zhì)譜條件 電子電離 （electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；離子源溫度為230 ℃；電子倍增管電壓350 V 溶劑延遲3 min；質(zhì)量掃描為全掃描方式，掃描范圍m/z 50～450。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品利用GC-MS 進行檢測，得到樣品的總離子流圖（Total ion current，TIC），根據(jù)其總離子流圖的保留時間和質(zhì)荷比進行峰的匹配，并采用峰面積歸一化法計算各個樣品揮發(fā)性成分的相對百分含量，得到原始數(shù)據(jù)矩陣。臍橙中的揮發(fā)性成分利用NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜圖庫檢索，結(jié)合匹配分值和相關(guān)的文獻確定各色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分，對其進行初步篩查鑒定。將得到的原始數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 軟件（Umetrics，瑞典）進行多維統(tǒng)計學(xué)分析。利用非監(jiān)督性的主成分分析（Principle Component Analysis，PCA）進行降維和對整體的分布趨勢進行預(yù)覽，采用有監(jiān)督性的正交偏最小二乘法判別分析 （Orthogonal partial Least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對其進行建模。根據(jù)分析結(jié)果結(jié)合spss 進行t 檢驗，篩選潛在生物標志物。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS 總離子流圖分析

按照上述方法依次測定各個臍橙樣本的揮發(fā)性成分，總離子流圖見圖1，圖1中非贛南臍橙揮發(fā)性成分總離子流圖在上方，下面為贛南臍橙的揮發(fā)性成分總離子流圖。由圖1可以看出，該方法所得譜圖的色譜峰分離度和豐度良好，且出峰較多；贛南臍橙與非贛南臍橙的揮發(fā)性成分峰形有較為明顯的差異，表明揮發(fā)性成分在臍橙中含量有所差異。

圖1 贛南臍橙和非贛南臍橙的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile components in Gannan navel orange and non Gannan navel orange

根據(jù)氣相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀配有的NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果進行匹配，并結(jié)合保留時間、特征離子、相對豐度以及相關(guān)文獻對贛南臍橙的揮發(fā)性成分進行了鑒定，鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，贛南臍橙樣品中共鑒定出66 種物質(zhì)，包括萜烯類、醛類、醇類、酯類、酮類等，其中含量最高的為D-檸檬烯。孫瑩等[18]對不同成熟度贛南“紐荷爾”臍橙通過GC-MS 對其香氣成分進行采集，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫匹配并結(jié)合文獻等相關(guān)分析，贛南臍橙中共檢測出68 中香氣成分，且D-檸檬烯含量最高。上述研究鑒定出的揮發(fā)性成分較本試驗揮發(fā)性物質(zhì)多，這可能是由于贛南臍橙保存方法和生長環(huán)境等不同的原因造成的。結(jié)合相關(guān)報道[18-20]的文獻可得，對臍橙檢測的揮發(fā)性成分及含量稍有不同，但D-檸檬烯含量均最高。D-檸檬烯是大多數(shù)柑橘類果實的最主要香氣成分。

表1 贛南臍橙揮發(fā)性成分的定性分析結(jié)果Table 1 Qualitative analysis of volatile components in Gannan navel orange

2.2 模型的構(gòu)建和驗證

試驗中首先將預(yù)處理的GC-MS 數(shù)據(jù)進行非監(jiān)督PCA 分析，獲得各地臍橙樣本在空間上的分布情況，如圖2a 所示。由圖2a 可知，贛南臍橙和非贛南臍橙有明顯分離，相同產(chǎn)地的臍橙之間距離很近，表明PCA 分析對贛南臍橙和非贛南臍橙的產(chǎn)地有較好的區(qū)分效果，說明不同產(chǎn)地的臍橙的揮發(fā)性成分含量有區(qū)別。監(jiān)督性O(shè)PLS-DA 分析可以剔除與樣品分組無關(guān)的因素，排除樣本之間的誤差及其它的隨機誤差，并使組間的差異得到最大化。因此采用OPLS-DA 分析，如圖2b 所示。由圖2b 可知，贛南臍橙和非贛南臍橙完全分開。模型的評價指標R2Ycum=0.985，Q2cum=0.71，說明所建模型良好。為了進一步驗證模型是否過擬合，采用200 次響應(yīng)的置換檢驗，結(jié)果見圖3。圖3中R2代表Y 變量的可解釋性，Q2代表模型的可預(yù)測性，由圖3可知，Q2于Y 軸的截距是負值，且置換檢驗得到的R2Ycun=0.939 和Q2cum=－0.269 均小于原始值，由此可得此模型沒有過擬合。

2.3 潛在標志物的篩選和鑒定

s-plot 圖能同時體現(xiàn)每個變量與模型某一成分之間的協(xié)變性和相關(guān)性，并可以用于鑒別具有生化意義的變量，因為它們分別代表變量在模型的貢獻大小和變量的權(quán)重系數(shù)。s-plot 圖中位于兩端的變量在模型的貢獻率越大，由此可用s-plot觀察和選擇差異性變量[17，21]。變量權(quán)重重要性排序（the variable importance in the projection，VIP）值可以評價變量的貢獻大小，通常選用VIP＞1 的變量[21-23]。在此基礎(chǔ)上，需用學(xué)生氏t 檢驗的P 值（閾值0.05）來驗證變量是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 GC-MS 分析臍橙樣本的PCA 圖（a）和OPLS-DA 圖（b）Fig.2 PCA score plot （a）and OPLS-DA score plot （b）of GC-MS data from navel orange

圖3 OPLS-DA 模型的置換檢驗Fig.3 Permutation test of OPLS-DA model

圖4 GC-MS 分析臍橙樣本的s-plot 圖Fig.4 s-plot of GC-MS data from navel orange

通過選用VIP＞1 并結(jié)合s-plot 圖篩選影響臍橙產(chǎn)地差異的顯著指標，如圖4所示，紅色標識為所篩選的差異顯著的24 種物質(zhì)。對于篩選的24種物質(zhì)進行t 檢驗，驗證這些變量在兩組之間是否含有統(tǒng)計學(xué)差異，并排除P＞0.05 的變量。結(jié)合上述篩選最終有5 種物質(zhì)符合要求，見表2，分別為（1S）-（+）-3-蒈烯、4-蒈烯、壬醛、（Z）-石竹烯、桉烷-3，7（11）-二烯，這些物質(zhì)可作為區(qū)分贛南臍橙和非贛南臍橙的潛在標志物。

表2 基于GC-MS 的贛南臍橙與非贛南臍橙的潛在生物標志物Table 2 Potential biomarkers of Gannan navel orange and non Gannan navel orange based on GC-MS

3 結(jié)論

本試驗通過GC-MS 分析贛南臍橙和其它地區(qū)臍橙中的揮發(fā)性物質(zhì)，利用NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜圖庫檢索并結(jié)合相關(guān)文獻，初步鑒定其揮發(fā)性物質(zhì)。臍橙中共檢測出66 種物質(zhì)，分別為萜烯類、醛類、醇類、酯類、酮類等，其中D-檸檬烯含量最高。并通過建立臍橙的OPLS-DA 模型，發(fā)現(xiàn)5 種物質(zhì)可作為區(qū)分贛南和其它地區(qū)臍橙的潛在生物標志物。這5 種物質(zhì)分別為（1S）-（+）-3-蒈烯、4-蒈烯、壬醛、（Z）-石竹烯、桉烷-3，7（11）-二烯。這可進一步保障市場上贛南臍橙的品質(zhì)，以謹防假冒偽劣。在今后的研究中，可擴大采樣范圍，并對潛在生物標志物進行系統(tǒng)性和深入性研究，使其結(jié)果更具有實用價值。