林亞楠 李詩言 崔益瑋 戴志遠(yuǎn)，3 陳 康，3 王 揚 沈 清，3*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心 杭州310023 3 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）

鱘魚（A.sinensis）又名鱘龍，是世界上最大的淡水魚類，其肉質(zhì)鮮美細(xì)膩，營養(yǎng)豐富，具有巨大的加工潛力[1]。目前我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)模已經(jīng)達(dá)到國際領(lǐng)先水平，鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的80%，成為我國重要的淡水經(jīng)濟魚類之一[2]。鱘魚加工產(chǎn)品種類相對較少，市場認(rèn)知度低，除了魚卵用于生產(chǎn)高價值的魚子醬外，魚體主要用于生產(chǎn)冰鮮鱘魚、速凍鱘魚丸、煙熏鱘魚片等[3-5]。鱘魚肉經(jīng)煙熏后具有特有的顏色和香味，然而也會從熏煙中引入有害物質(zhì)[6]。雖然目前液熏法能有效避免稠環(huán)芳烴等化合物，但是其風(fēng)味無法與煙熏法比擬[7]。

苯并芘（Benzopyrene）又稱苯并（a）芘，它可損傷DNA，造成細(xì)胞癌變，對內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，是一種致癌性很強的化合物[8]。3，4-苯并芘（3，4-BaP）是所有稠環(huán)芳烴中最具代表性的一種，其致癌作用明顯高于其它稠環(huán)芳烴，小劑量就有可能引起局部組織的癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA、肺細(xì)胞和肝細(xì)胞損傷，因此成為人們關(guān)注的熱點[9]。水產(chǎn)品中BaP 的來源主要包括原料污染和加工過程污染，如養(yǎng)殖水污染造成BaP 在生物體內(nèi)富集，燒烤、煙熏、烘烤時受高溫影響發(fā)生裂解與熱聚合等反應(yīng)形成[10]。我國《GB 2762-2005 食品中污染物限量》明確規(guī)定，食用油標(biāo)準(zhǔn)不超過10 mg/kg，熏烤肉不超過5 mg/kg，糧食不超過5 mg/kg，限量要求與歐盟、世衛(wèi)組織制定的標(biāo)準(zhǔn)一致[11]。

目前煙熏水產(chǎn)品中的3，4-BaP 提取主要包括正己烷等有機溶劑液-液萃取法[12]、中性氧化鋁富集凈化法[13]、無機/有機復(fù)合材料固相微萃取法[14]等前處理方法。檢測方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[15]、高效液相色譜法（HPLC）[16]、液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[17]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[18]等，其中GB/T22509-2008 和國際標(biāo)準(zhǔn)化方法ISO 15302-2007 推薦的固相萃取結(jié)合HPLC 法在生產(chǎn)實踐中殘留檢測應(yīng)用相對較廣泛[19-20]。然而，該方法存在著3，4-BaP 特異性不強、靈敏度低等問題，難以滿足人們對食品安全的要求[21]。另外，煙熏水產(chǎn)品中含有較多小分子雜質(zhì)，對3，4-BaP 的測定不利，要求更精細(xì)的前處理過程和更優(yōu)的色譜分離條件[22]。

本試驗擬針對3，4-BaP 結(jié)構(gòu)特征合成特異性固相萃取吸附填料，建立煙熏鱘魚中3，4-BaP 的分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，以期對市場上煙熏鱘魚產(chǎn)品進行監(jiān)測，為職能部門提供相關(guān)試驗依據(jù)，進而為消費者食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3，4-BaP 標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥99%，美國Sigma Aldrich 公司），以甲醇為溶劑分別配置3，4-BaP標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10 μg/mL），臨用時以基質(zhì)提取液將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)工作液；柱套和篩板取自去填料的商品化6 mL 固相萃取柱，美國Waters公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國TEDIA 公司；試驗用水為Milli-Q 高純水；甲苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、4-乙烯基吡啶、3-氨丙基三乙氧基硅烷、三乙胺、偶氮二異丁腈（AIBN）等試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity 系列超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；4000 Qtrap 三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX 公司；Multi Reax 全能型振蕩器，德國Heidolph 公司；Allegra X-12 高速離心機，美國BECKMAN 公司；5427R 臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Milliplus 2150 超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 3，4-BaP 提取 將煙熏鱘魚去骨去皮后，取可食用肌肉組織攪碎并斬拌均勻成煙熏鱘魚糜；稱取5 g 樣品，加入50 mL 乙腈-丙酮混合提取液（3∶2，V/V）后振蕩使混合均勻；將混合物轉(zhuǎn)移至離心管中，加入過量的氯化鈉，以8 000 r/min 離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，于-70℃靜置30 min 后迅速于-20 ℃冷凍離心；將上清液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以2 mL 正己烷復(fù)溶，置于4 ℃保存。

1.3.2 分子印跡填料合成 向蒸餾瓶中加入100 g 硅膠，用體積分?jǐn)?shù)10%的HCl 回流10 h，用蒸餾水洗滌至中性，得到活化硅膠干燥后備用；取5 g 活化硅膠和50 mL 無水甲苯放入圓底燒瓶中，加入2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和1 mL 三乙胺，加熱回流24 h，將反應(yīng)后的表面硅烷化硅膠過濾，使用甲醇、二氯甲烷洗滌并干燥；取0.5 mmol苯并芘（模板分子）溶解于5 mL 甲醇和15 mL 二氯甲烷，加入2 mmol 功能單體4-乙烯基吡啶，2 g硅烷化硅膠，低溫振蕩3 h，使混合充分；加入7.5 mmol 交聯(lián)劑EGDMA 和0.1 g 引發(fā)劑AIBN，排出空氣后于50 ℃反應(yīng)48 h，洗滌后干燥備用。

1.3.3 固相萃取 稱取3，4-BaP 分子印跡聚合物500 mg 混合懸浮在二氯甲烷中，填裝到6 mL 的固相萃取空柱中，上端再加入篩板，壓緊制成分子印跡固相萃取柱。

依次用5 mL 二氯甲烷和正己烷活化BISPE柱；將2 mL 提取液緩慢流經(jīng)柱體，使提取液中的3，4-BaP 與填料充分結(jié)合；使用10 mL 正己烷淋洗；真空負(fù)壓抽干后，使用5 mL 二氯甲烷將BISPE 上的3，4-BaP 洗脫，收集液再40 ℃下氮氣吹干，用1 mL 乙腈定容，過0.22 μm 親水PTFE 濾膜，待測。繼續(xù)使用5 mL 二氯甲烷淋洗BISPE 柱3 次，經(jīng)檢測無目標(biāo)物洗出，小柱可以重復(fù)使用20次以上。

1.3.4 液相色譜條件 液相色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），配套保護柱VanGuard BEH C18 （5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為超純水；流速：0.60 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫條件：0～4 min，70%～95%A；4～6 min，95%A；6～8 min，95%～70%A；8～10 min，70%A。

1.3.5 質(zhì)譜條件 大氣壓化學(xué)電離（APCI）離子源，正離子掃描方式多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化電壓（IS）：5 500V，離子源溫度（TEM）：600℃，氣簾氣（CUR）：40 psi，噴霧氣（GS1）：50 psi，碰撞氣（CAD）：medium；其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaP 分子印跡材料表征

由圖1可見，利用分子印跡技術(shù)制備的3，4-BaP 分子印跡固相萃取填料是一種球狀顆粒，其外徑在20～90 μm 不等，顆粒間分散性較強，以此填充的固相萃取柱具備較優(yōu)的多路徑效應(yīng)和徑向軸向擴散效應(yīng)，較低的固定相和流動相間的傳質(zhì)阻力。

圖1 不同放大倍率下的3，4-BaP 分子印跡聚合物的掃描電鏡圖Fig.1 SEM of 3，4-BaP molecular imprinted polymer

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，直接使用有機溶劑提取煙熏鱘魚中3，4-BaP 時，提取溶液中的基質(zhì)干擾物較多，基質(zhì)效應(yīng)造成的信號噪音較強烈，對色譜柱和質(zhì)譜儀均產(chǎn)生不利的影響。煙熏鱘魚樣品中主要是大分子蛋白質(zhì)，小分子脂肪和碳水化合物等。采用分子印跡固相萃取并對萃取條件進行優(yōu)化，可有效富集樣品中的3，4-BaP，去除干擾物。

2.2.1 不同填料比較 試驗首先比較了極性分配固相萃取柱（Waters Sep-pak C18 500 mg/6 mL）、親水親脂平衡固相萃取柱（Waters Oasis HLB，150 mg/6 mL），F(xiàn)lorisil（Strata FL-PR Florisil，1 000 mg/6 mL）和分子印跡固相萃取柱（500 mg/6 mL）。分別考察5，10 和50 μg/kg 三濃度水平下的加標(biāo)回收率來評價這4 種固相萃取柱對3，4-BaP 的萃取效率。結(jié)果如圖2所示，三濃度水平下，BISPE 的萃取效率均顯著高于其它固相萃取柱，Sep-pak SPE 次之，HLB 和Florisil 相對較差。3 種濃度水平下，各固相萃取柱表現(xiàn)基本穩(wěn)定。因此，本試驗采用BISPE 為3，4-BaP 富集凈化方法。

2.2.2 淋洗條件優(yōu)化 3，4-BaP 分子印跡固相萃取在富集煙熏鱘魚提取物中痕量殘留目標(biāo)物時可能存在非特異性吸附，因此本試驗通過優(yōu)化淋洗條件，最大限度地提高分子印跡填料結(jié)合位點和3，4-BaP 分子之間的選擇性作用，去除非特異性作用和基質(zhì)干擾。本試驗分別以甲醇、乙腈、正己烷作淋洗液，測定空白煙熏鱘魚提取液中不同濃度3，4-BaP 加標(biāo)回收率。結(jié)果如圖3，甲醇和乙腈選擇性不佳，經(jīng)其淋洗后的3，4-BaP 回收率分別為81.5%和87.4%，均會造成一定量3，4-BaP 的損失；正己烷選擇性較好，能有效去除脂類等有機雜質(zhì)，保留分子印跡對3，4-BaP 的吸附性能。

2.2.3 洗脫條件優(yōu)化 洗脫溶劑必須破壞目標(biāo)物與分子印跡填料結(jié)合位點間的作用，從而獲得高富集因子。本試驗比較了幾種常用的SPE 洗脫劑，包括甲醇、乙腈、二氯甲烷和正己烷，結(jié)果見圖3。甲醇和乙腈是最為常用的洗脫劑，然后其對3，4-BaP 的洗脫效果均不是太理想，回收率≤90%；而正己烷洗脫效果最差，僅為69.3%；二氯甲烷與3，4-BaP 相似相溶性最佳，洗脫效果最佳，3，4-BaP 回收率達(dá)到96.4%。

圖2 不同固相萃取柱在3 個濃度水平下對3，4-BaP的萃取效率的影響Fig.2 The effect of SPE sorbent on the recovery of 3，4-BaP under three concentrations

圖3 不同淋洗液和洗脫液對3，4-BaP的回收率的影響Fig.3 The effect of washing and eluting solvents on the recovery of 3，4-BaP

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件是影響方法靈敏度的關(guān)鍵因素之一[23-25]。由于3，4-BaP 為弱極性化合物，在電噴霧離子（ESI）源中不易電離，信號響應(yīng)較低，可在大氣壓化學(xué)電離源（APCI）中以正離子的方式電離。使用針泵注射器以10 μL/min 的流速將10 μg/kg的3，4-BaP 標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中，在APCI 正離子檢測方式下對質(zhì)譜測定條件進行優(yōu)化。Q1 掃描時可見[M+H]+分子離子峰m/z 為253.2，以分子離子峰進行子離子掃描 （Product ion scan，PIS），得到豐度較高的碎片離子信息，如m/z 224.1 和m/z 226.1 等。然后再對離子源溫度、去簇電壓（Declustering potential，DP）、碰撞能量（Collision energy，CE）等參數(shù)進行優(yōu)化，使離子對信號達(dá)到最佳。根據(jù)2002/657/EC 確證分析需要4 個識別點，故選擇兩對分子離子對，同時設(shè)定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數(shù)為12～18 點，從而得到較好的定量重復(fù)性。

表1 3，4-BaP 色譜質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters of mass spectrometry for the detection of 3，4-BaP

圖4 分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用檢測3，4-BaP色譜圖（50 μg/kg）Fig.4 The chromatogram of 3，4-BaP using molecular imprinted solid-phase extraction/ultra-performance liquid chromatography （50 μg/kg）

2.4 方法驗證

取適量3，4-BaP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用空白基質(zhì)溶液配制成6 種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以3，4-BaP 色譜圖的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，μg/kg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程y=3 726x+1 233.5，線性范圍5～1 000 μg/kg，和相關(guān)系數(shù)0.9998。同時，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進行測定，分別根據(jù)3 和10 倍信噪比（S/N）確定被測物的方法檢出限（LoD）和定量限（LoQ）。結(jié)果表明，3，4-BaP 的線性良好，檢出限和定量限分別為0.98 和3.16 μg/kg，滿足3，4-BaP 高靈敏度檢測的需要。在空白煙熏鱘魚樣品中添加3，4-BaP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成含量分別為5，10 和50 μg/kg 的加標(biāo)樣品，按上述前處理方法及測定條件進行精密度和回收率試驗，每個添加水平做6 次平行測定。結(jié)果如表2所示，三濃度水平下3，4-BaP 的日內(nèi)精密度和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.26%～4.77%和3.78%～5.26%，該試驗方法重現(xiàn)性較強；3，4-BaP 的方法回收率為89.7%～95.3%，RSD 為2.89%～3.44%，回收率較高，符合痕量分析的要求。

表2 3，4-BaP 分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用法的靈敏度、精密度和回收率Table 2 The sensitivity，accuracy，and recovery of 3，4-BaP using BISPE based UPLC-MS/MS

2.5 煙熏鱘魚中3，4-BaP 含量測定

采用本試驗建立的分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用法對市售30 批次煙熏鱘魚和20 批次課題組研發(fā)的煙熏鱘魚進行檢測，并對結(jié)果進行數(shù)理統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 個批次煙熏鱘魚中，共計12個樣品檢出3，4-BaP 為陽性，檢出率為24%，除了1 批次煙熏鱘魚3，4-BaP 含量達(dá)21.9 μg/kg 以外，其余批次煙熏鱘魚中雖有3，4-BaP 陽性信號，但是低于定量限，符合國際限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本試驗建立了檢測煙熏鱘魚中3，4-BaP 的分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用方法。對BISPE 的樣品凈化效果和基質(zhì)效應(yīng)進行評估，合成的填料對樣品中3，4-BaP 具有特異吸附效果，達(dá)到了顯著的富集和凈化效果。通過對質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化，得到了較高的檢測靈敏度和穩(wěn)定性。方法學(xué)驗證結(jié)果表明本方法靈敏度高、精密度好、定量準(zhǔn)確。將3，4-BaP 的分子印跡固相萃取/液質(zhì)聯(lián)用方法應(yīng)用于煙熏鱘魚中3，4-BaP 檢測發(fā)現(xiàn)12 批次陽性樣品，除一批次以外均符合國際限量標(biāo)準(zhǔn)。與中性氧化鋁等常規(guī)填料的固相萃取柱相比，BISPE 柱在3，4-BaP 分子選擇性、回收率、穩(wěn)定性方面更加優(yōu)秀。該方法適用于煙熏鱘魚中3，4-BaP 殘留檢測，相關(guān)數(shù)據(jù)能為職能部門決策提供依據(jù)和參考，進而為消費者食品安全提供保障。