陳海燕，劉華東，李冰，覃佩莉

(1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530023；2.廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司，南寧 530023)

百合固金片由玄參、地黃、熟地黃、白芍、百合等10味中藥材按處方工藝加工而成，具有養(yǎng)陰潤肺、化痰止咳功效，主要用于肺腎陰虛、燥咳少痰、痰中帶血、咽干喉痛等癥的治療?，F(xiàn)代研究表明，百合固金制劑治療特發(fā)性肺纖維化療效明顯[1]，對肺癌具有減輕臨床癥狀、提高化療效果、減輕化療毒副作用、增加化療敏感性、改善生活質(zhì)量等特點[2]，該藥聯(lián)合左氧氟沙星治療社區(qū)獲得性肺炎不僅可以改善臨床癥狀，還可降低機體炎癥反應(yīng)[3]；聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸能改善慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者臨床癥狀及肺功能[4]。百合固金片收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部[5]，標(biāo)準(zhǔn)中僅對佐藥白芍所含芍藥苷的含量進行了測定，筆者僅檢索到對該制劑所含芍藥苷進行檢測的文獻(xiàn)[6]。單一成分難以有效控制中成藥復(fù)方制劑質(zhì)量均一性，多指標(biāo)評價模式已廣泛應(yīng)用于中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制，但普通的多指標(biāo)評價模式在實驗過程中所用對照品用量大，部分對照品存在不穩(wěn)定、價格昂貴等因素；一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)利用百合固金片所測各成分間內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，建立各成分間的相對校正因子，通過測定一個易得、價格低廉成分的對照品實現(xiàn)多個成分的同步測定。筆者在本實驗采用一測多評法，以芍藥苷為參照，建立其與哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的相對校正因子，同步測定君藥地黃和熟地黃3種成分梓醇、毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，臣藥玄參2種成分哈巴苷和哈巴俄苷，佐藥白芍4種成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量，并與外標(biāo)法進行對比，較全面地控制百合固金片質(zhì)量，以期為提高百合固金片質(zhì)量控制方法提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀，配備G1314A 可變波長檢測器(美國安捷倫公司)，Waters E2695型高效液相色譜儀，配備2998可變波長檢測器(美國Waters公司)；色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 、Waters Sunfire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 和Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BP211D型電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.1 mg)；SB52000型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2試藥 哈巴苷對照品(批號：111729-201707，含量：96.8%)、哈巴俄苷對照品(批號：111730-201709，含量：95.9%)、梓醇對照品(批號：110808-201711，含量：99.6%)、毛蕊花糖苷對照品(批號：111530-201713，含量：92.5%)和芍藥苷對照品(批號：110736-201842，含量：97.4%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；焦地黃苯乙醇苷B1對照品(批號：120406-37-3，含量：98.0%)來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；氧化芍藥苷對照品(批號：39011-91-1，含量：98.0%)來源于成都曼思特生物科技有限公司；芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號：39011-90-0，含量：98.0%)和苯甲酰芍藥苷對照品(批號：38642-49-8，含量：98.0%)來源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純；百合固金片(規(guī)格：每片0.45 g，批號：180102，180301，180402)來源于廣東萬方制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脫(0～15.0 min，19.0%A；>15.0～24.0 min，19.0%A→25.0%A；>24.0～37.0 min，25.0%A→29.0%A；>37.0～53.0 min，29.0%A→41.0%A；>53.0～60.0 min，41.0%A→19.0%A)；0～29.0 min時在210 nm[5，7-12]波長下檢測哈巴苷、哈巴俄苷和梓醇，29.0～37.0 min在330 nm[10-11]波長下檢測毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，37.0～60.0 min時在230 nm[5-6，13-16]波長下檢測氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷；流量0.9 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按所測各色譜峰計均大于3 500，9種成分與相鄰峰分離度均>1.5。

2.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷對照品適量，用稀乙醇分別制成9種單成分對照品儲備液(哈巴苷0.858 mg·mL-1、哈巴俄苷0.294 mg·mL-1、梓醇3.792 mg·mL-1、毛蕊花糖苷1.936 mg·mL-1、焦地黃苯乙醇苷B10.712 mg·mL-1、氧化芍藥苷0.376 mg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷1.318 mg·mL-1、芍藥苷2.552 mg·mL-1、苯甲酰芍藥苷0.214 mg·mL-1)；再依次精密吸取單成分對照品儲備液各適量，用稀乙醇制成每毫升含哈巴苷0.042 9 mg、哈巴俄苷0.014 7 mg、梓醇0.189 6 mg、毛蕊花糖苷0.096 8 mg、焦地黃苯乙醇苷B10.035 6 mg、氧化芍藥苷0.018 8 mg、芍藥內(nèi)酯苷0.065 9 mg、芍藥苷0.127 6 mg、苯甲酰芍藥苷 0.010 7 mg混合對照品溶液。

2.3百合固金片供試品溶液的制備 取百合固金片適量，除去薄膜衣，研成細(xì)粉，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL[5-6]，稱定質(zhì)量，SB52000型超聲波清洗器超聲(功率：200 W，頻率：40 kHz)提取30 min，放冷，用稀乙醇補足損失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液即得百合固金片供試品溶液。

2.4陰性樣品溶液的制備 按照《中華人民共和國藥典》2015年版一部百合固金片的處方和制備工藝，分別制備不含地黃和熟地黃的陰性樣品、不含玄參的陰性樣品、不含白芍的陰性樣品，再按照“2.3”項方法分別制備3種陰性樣品溶液。

2.5專屬性考察 取混合對照品溶液、百合固金片供試品溶液、地黃和熟地黃陰性樣品溶液、玄參陰性樣品溶液和白芍陰性樣品溶液適量，在上述色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，百合固金片供試品溶液所測成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷色譜峰保留時間和對照品溶液中所測各成分的保留時間一致，其他成分對測定無干擾，陰性樣品對測定無干擾。

2.6線性范圍實驗 分別精密吸取“2.2”項哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷9種單成分對照品儲備液各2.0 mL，置于同一20 mL量瓶，采用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)液Ⅰ；再精密吸取混合標(biāo)液Ⅰ各適量，依次用稀乙醇稀釋2，4，8，16，20倍，制成混合標(biāo)液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。依次精密吸取混合標(biāo)液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各適量，進樣檢測，記錄哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷9種成分色譜峰的峰面積，以哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷9種單成分的回歸方程，結(jié)果見表1。

2.7精密度實驗 取“2.2”項混合對照品溶液進行測定，連續(xù)進樣6次，記錄哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的峰面積，結(jié)果所測各成分峰面積的RSD分別為0.83%，1.07%，0.51%，0.34%，0.75%，0.91%，0.65%，0.60%和1.18%(n=6)。

2.8重復(fù)性實驗 取同一批次百合固金片適量，按照“2.3”項百合固金片供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，進樣測定，記錄哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的峰面積，計算所測各成分的含量，結(jié)果所測9種成分含量的RSD分別為1.54%，0.71%，0.87%，0.96%，1.39%，1.67%，0.25%，1.06%和0.89%(n=6)。

2.9穩(wěn)定性實驗 取同一批次百合固金片的同一份供試品溶液，室溫下放置，在上述色譜條件下0，2，4，8，16，24 h分別進樣檢測，記錄哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的峰面積，結(jié)果百合固金片供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定，所測各成分峰面積的RSD分別為0.77%，1.06%，0.53%，0.61%，0.78%，1.03%，0.62%，0.58%和1.14%(n=6)。

2.10加樣回收率實驗 取已知含量的同一批次百合固金片6份，研成細(xì)粉，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入另行配制的0.639 mg·mL-1哈巴苷對照品溶液、0.198 mg·mL-1哈巴俄苷對照品溶液、2.195 mg·mL-1梓醇對照品溶液、1.317 mg·mL-1毛蕊花糖苷對照品溶液、0.552 mg·mL-1焦地黃苯乙醇苷B1對照品溶液、0.261 mg·mL-1氧化芍藥苷對照品溶液、0.969 mg·mL-1芍藥內(nèi)酯苷對照品溶液、1.937 mg·mL-1芍藥苷對照品溶液和0.141 mg·mL-1苯甲酰芍藥苷對照品溶液各1.0 mL，精密加入稀乙醇16 mL，按照“2.3”項方法制備加樣供試品溶液，依次進樣測定，結(jié)果所測成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的平均加樣回收率分別為98.92%，97.96%，99.73%，99.03%，97.78%，97.29%，98.69%，100.12%和96.94%，RSD分別為0.97%，1.30%，1.11%，0.85%，1.25%，1.02%，0.98%，0.78%和1.51%(n=6)。

A.混合對照品；B.百合固金片供試品；C.玄參陰性樣品；D.地黃熟地黃陰性樣品；E.白芍陰性樣品；1.哈巴苷；2.哈巴俄苷；3.梓醇；4.毛蕊花糖苷；5.焦地黃苯乙醇苷B1；6.氧化芍藥苷；7.芍藥內(nèi)酯苷；8.芍藥苷；9.苯甲酰芍藥苷。

圖1 5種樣品的HPLC色譜圖

A.mixed reference substance；B.sample ofBaiheGujinTablet；C.negative sample ofScrophulariaeRadix；D.negative sample ofRehmanniaeRadixandRehmanniaeRadixPraeparata；E.negative sample ofPaeoniaeRadixAlba；1.harpagide； 2.harpagoside；3.catalpol；4.verbascoside；5.jionoside B1；6.oxypaeoniflorin； 7.albiflorin；8.paeoniflorin；9.benzoylpaeoniflorin.

Fig.1HPLCchromatogramoffivekindsofsample

表1 百合固金片中9種成分的線性關(guān)系

Table.1LinearrelationshipofninecomponentsinBaiheGujinTablet

成分線性方程線性范圍/(μg·mL-1)r哈巴苷A=7.239 1×105C-919.34.29～85.800.999 3哈巴俄苷A=8.991 4×105C+453.01.47～29.400.999 2梓醇A=1.000 6×106C-829.718.96～379.200.999 5毛蕊花糖苷A=1.124 2×106C+317.09.68～193.600.999 3焦地黃苯乙醇苷B1A=6.864 9×105C+724.83.56～71.200.999 1氧化芍藥苷A=1.011 0×106C-350.41.88～37.600.999 6芍藥內(nèi)酯苷A=5.911 9×105C+148.66.59～131.800.999 4芍藥苷A=1.303 4×106C-869.312.76～255.200.999 1苯甲酰芍藥苷A=9.220 5×105C+413.41.07～21.400.999 3

2.11相對校正因子的計算 相對校正因子的計算公式k/s=(CkAs)/(CsAk)(式中C為所測各成分質(zhì)量濃度，A為所測各成分峰面積，k為其他成分，s為參照成分)。精密吸取“2.6”項混合標(biāo)液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ，依法進樣檢測，記錄各成分色譜峰峰面積，以芍藥苷為參照，分別計算哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的相對校正因子，結(jié)果見表2。

2.12待測成分相對校正因子耐用性考察 在Agilent 1100型高效液相色譜儀、Waters E2695型高效液相色譜儀2種高效液相色譜儀上，分別考察本色譜條件在Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)、Waters Sunfire C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)3種色譜柱上的相對校正因子值，結(jié)果見表3。

表2 以芍藥苷為參照的相對校正因子

表3 不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.13待測成分色譜峰的定位 采用相對保留值法對所測各成分色譜峰進行定位，以芍藥苷為參照，考察所測成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷在2種高效液相色譜儀(Agilent 1100型高效液相色譜儀、Waters E2695型高效液相色譜儀)和3種不同品牌色譜柱(Diamonsil C18柱、Waters Sunfire C18柱和Agilent Eclipse XDB-C18柱)條件下與參照成分芍藥苷的相對保留值，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明2種高效液相色譜儀和不同品牌色譜柱條件下所測成分相對保留值無明顯差異。

2.14外標(biāo)法與一測多評法測定結(jié)果比較 取3批百合固金片樣品(批號：180102，180301，180402)適量，按照“2.3”項方法制備供試品溶液，依法進樣測定哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的峰面積，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1指標(biāo)成分的選擇 百合固金片由玄參、地黃、熟地黃、白芍、百合等10味中藥材加工而成，方中地黃、熟地黃滋陰養(yǎng)血、清熱涼血，百合甘苦微寒、滋陰清熱、潤肺止咳，三藥共為君藥；方中玄參咸寒，助二地滋陰壯水，以清虛火，麥冬甘寒，助君藥滋陰清熱、潤肺止咳，共為臣藥；方中當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和血，川貝母潤肺止咳化痰，桔梗載藥上行、清利咽喉、化痰散結(jié)，共為佐藥；方中甘草調(diào)和諸藥，為使藥。筆者選取百合固金片君藥地黃和熟地黃所含主要成分梓醇、毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，臣藥玄參所含特征成分哈巴苷和哈巴俄苷，佐藥白芍所含主要成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷為考察指標(biāo)，采用QAMS建立百合固金片的含量測定方法，從而更加全面科學(xué)地控制百合固金片的質(zhì)量。

3.2流動相的考察 筆者在本實驗中考察了不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液[9]、乙腈-0.1%磷酸溶液[5，10，13，15]、乙腈-0.2%磷酸溶液[11，14])對所測定成分哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷峰形、出峰時間、分離度等指標(biāo)的影響，通過摸索，最終采用乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)作為流動相按照文中的梯度洗脫比例，對百合固金片所含哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷進行同時測定。

表4 不同色譜柱對相對保留值的影響

表5 百合固金片中9種成分含量測定結(jié)果

Table.5ResultsofcontentdeterminationonninecomponentsinBaiheGujinTabletmg·g-1

批號芍藥苷外標(biāo)法哈巴苷外標(biāo)法QAMS哈巴俄苷外標(biāo)法QAMS梓醇外標(biāo)法QAMS毛蕊花糖苷外標(biāo)法QAMS1801021.9420.6410.6380.2020.2042.2162.2231.3221.3171803011.7490.6720.6660.2310.2291.9982.0051.1911.1961804022.2220.5500.5540.1740.1762.3202.3131.5181.513批號焦地黃苯乙醇苷B1外標(biāo)法QAMS氧化芍藥苷外標(biāo)法QAMS芍藥內(nèi)酯苷外標(biāo)法QAMS苯甲酰芍藥苷外標(biāo)法QAMS1801020.5490.5550.2570.2600.9740.9790.1430.1451803010.4690.4720.2910.2940.8790.8830.1230.1201804020.6270.6240.2200.2221.1141.1090.1620.163

筆者在本實驗建立的QAMS同時測定百合固金片中哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量，方法便捷、準(zhǔn)確度好、精密度高，可作為該制劑的有效質(zhì)量控制方法。