姚佳麗，李魯俊，楊鳳娟，2，3*，王秀峰，2，魏珉，3，4，史慶華，3，4

1.山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018

2.農業(yè)農村部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，山東 泰安 271018

3.山東果蔬優(yōu)質高效生產協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 泰安 271018

4.農業(yè)農村部黃淮海設施農業(yè)工程科學觀測實驗站，山東 泰安 271018

黃瓜是設施栽培的主要蔬菜作物之一，在生產過程中經常遇到鹽害等逆境脅迫。高濃度鹽漬化逆境主要通過滲透、離子和氧化脅迫使植物受到傷害[1-3]，從而影響植物能量和物質代謝[4]，使植物生長受到抑制甚至導致死亡[5]。植物一般通過調節(jié)自身的形態(tài)特征與生理生化過程來適應輕度鹽脅迫[6]；而通過合成滲透調節(jié)物質、區(qū)隔過量離子及清除活性氧等響應來減輕高鹽環(huán)境造成的脅迫損害，這些響應主要包括信號感知、信號轉導、基因表達及相應產物產生等在內的信號系統(tǒng)[7]。細胞膜是植物細胞感知并傳遞環(huán)境脅迫信號的最重要部位。鹽脅迫下，植物通過細胞膜將胞外脅迫信號傳遞至胞內，進而在胞內引發(fā)一系列信號級聯反應；其自身也能作為前體參與第二信使1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）、二脂酰甘油（DAG）、磷脂酸（PA）等合成，而參與磷脂信號通路[8]。

磷脂酶D（PLD）能夠水解膜磷脂產生第二信使分子PA，PA能激活促分裂蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號流和離子通道活性等引發(fā)一系列次級反應，從而完成細胞響應外部信號的過程[9，10]。在信號傳遞過程中，MAPK級聯信號系統(tǒng)起著承上啟下，將信號整合、放大和傳遞的作用[11]。林峰[12]研究發(fā)現，AtPLDα1缺失使突變體對鹽更加敏感，而外施PA則可緩解鹽脅迫現象；Li等[13]研究發(fā)現，將番茄SpMPK3轉入擬南芥中可顯著提高鹽脅迫和干旱脅迫下種子的發(fā)芽率和抗氧化能力，表明SpMPK3是響應擬南芥萌發(fā)和發(fā)育階段干旱和鹽脅迫的正調控因子。劉文瑜等[14]研究發(fā)現低濃度的NO可激活抗氧化系統(tǒng)酶活性以減輕鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子的傷害。鹽脅迫抑制黃瓜幼苗植株的生長及光合電子傳遞、降低葉片凈光合速率[15]，嚴重加劇膜脂過氧化程度[16]。Yu等[17]和莊寶程[18]研究發(fā)現，PA能與MAPK級聯信號中的成分特異性結合，表明PLD信號轉導途徑與MAPK級聯信號轉導途徑在響應逆境信號中存在關聯性。故本試驗擬通過NaCl處理模擬鹽害，測定處理前0 h和處理后0.5 h、1 h、3 h、5 h和10 h黃瓜幼苗葉片中磷脂酶Dα（CsPL Dα）和促分裂原活化蛋白激酶（CsNMAPK）基因表達、PA、NO和活性氧等信號物質的變化，以期探明CsPLDα和CsNMAPK及各種信號分子對鹽脅迫的響應機制，為豐富黃瓜耐鹽機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

以‘新泰密刺’黃瓜品種為試材。試驗于2017 年4～6 月在山東農業(yè)大學本部玻璃溫室內進行。經浸種催芽后的種子播于裝有基質（草炭：蛭石：珍珠巖=2:1:1）的穴盤中，待第1 片真葉展平時，將幼苗轉入盛5 L 營養(yǎng)液的水培盆中，每盆6 株。營養(yǎng)液中大量元素參照山崎配方[19]略加修改，微量元素參照Arnon 配方，pH 值用H2SO4調節(jié)在6.0～6.5 之間。待幼苗長至3 葉1 心時，一次性使營養(yǎng)液中的NaCl 濃度達100 mM，分別在處理0 h、0.5 h、1 h、3 h、5 h 和10 h 后取樣并測定相關指標，重復3 次。

1.2 測定項目與方法

CsNMAPK和CsPLDα的mRNA 表達量參照Li 等[20]、Livak 和Schmittgen[21]的方法，通過實時熒光定量PCR 進行測定。CsNMAPK和CsPLDα的蛋白表達量通過Western blot 進行測定，所用抗體由艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司制備。PA 含量采用雙抗體夾心法測定，提取參照陶銀華[22]的方法并加以修改。NO 含量采用蘇州科銘生物技術有限公司一氧化氮含量測定試劑盒進行測定。O2.-的組織化學染色參考Jabs 等[23]的方法。H2O2染色用3，3’-diaminobenzidine（DAB），參考Veljovic-Jovanovic 等[24]的方法。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Prochazkova 等[25]方法；過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性測定參照Cakmak 等[26]方法；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Nakano 和Asada[27]的方法。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2010 軟件處理數據和繪圖，采用DPS V14.10 軟件進行統(tǒng)計、相關性分析，采用新復極差法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 表達量的影響

圖1 所示，隨NaCl 處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK基本呈先升高后降低趨勢。處理1 h 后CsPLDα表達量達最大值，為0 h 表達量的6.65 倍，差異顯著；而處理3 h 后CsNMAPK表達量達最大值，為0 h 表達量的15.56 倍，差異顯著，且兩基因表達量均在處理10 h 后略有上升。

圖1 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα(A)和CsNMAPK(B)相對表達量的影響Fig.1 Effects of NaCl stress on relative expression of CsPLDα(A)and CsNMAPK(B)in cucumber seedling leaves

2.2 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 蛋白表達量的影響

NaCl 處理后0～10 h 范圍內，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα蛋白表達量均得到明顯誘導，在處理1 h后表達量較高，處理5 h后的表達量亦稍高于其它處理。隨NaCl處理時間延長，幼苗葉片中CsNMAPK表達量呈先增后降趨勢，處理3 h 后表達量較高，其它處理時間下表達量差異不明顯(圖2)。

圖2 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 蛋白表達量的影響Fig.2 Effects of NaCl stress on CsPLDα and CsNMAPK protein expression in cucumber seedling leaves

2.3 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中磷脂酸含量的影響

由圖3A 可以看出，隨處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中PA 含量亦呈先升高后降低趨勢。在NaCl處理3 h 后，PA 含量達到較高值，比處理0 h 顯著增加18.6%，隨后其含量逐漸降低。

圖3 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中磷脂酸（A）和一氧化氮（B）含量的影響Fig.3 Effects of NaCl stress on the content of PA(A)and NO(B)in cucumber seedling leaves

2.4 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中一氧化氮含量的影響

由圖3B 可知，NaCl 處理0～10 h 范圍內，黃瓜幼苗葉片中一氧化氮（NO）含量在處理1 h 后顯著升高，比處理0 h 增加9.1%，隨后逐漸下降，且其它處理時間，其含量均低于0 h 處理。

2.5 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中過氧化氫和超氧陰離子含量的影響

圖4 顯示，隨處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）含量均呈逐漸升高趨勢。

圖4 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中過氧化氫（A）和超氧陰離子（B）含量的影響Fig.4 Effects of NaCl stress on the content of H2O2和O2·in cucumber seedling leaves

2.6 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中抗氧化酶活性的影響

如圖5 所示，隨處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中抗氧化酶活性基本呈先降低后升高再降低趨勢，在處理0.5 h 后，其SOD、CAT、POD 和APX 活性均顯著低于0 h。SOD 活性在處理3 h 后達到較高值，但與處理0 h 無顯著差異，處理0.5 h、1 h、5 h 和10 h 后其活性均顯著低于處理0 h 后的活性；CAT、POD 和APX 活性均在處理5 h 后達較高值，分別比處理0 h 增加31.3%、33.0%和15.6%，在處理10 h 后略有降低。

圖5 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中超氧化物歧化酶(A)、過氧化氫酶(B)、過氧化物酶(C)和抗壞血酸過氧化物酶(D)活性的影響Fig.5 Effects of NaCl stress on the activities of SOD(A),CAT(B),POD(C)and APX(D)in cucumber seedling leaves

3 討論

研究表明，植物能夠感受并迅速應答各種脅迫的信號轉導過程，與特異的磷脂酶D（PLD）和下游產物磷脂酸（PA）激活有關[28]；PA 是植物中重要的脂質信號分子，被稱為“脂質第二信使”，參與多種逆境脅迫相關的信號傳導途徑[29]。而許多信號途徑依靠支架蛋白提供的定位點，與信號通路中的成員結合進而有效傳遞信號，特別是MAPK 級聯途徑。當用NaCl 處理擬南芥細胞或幼苗時，AtPLDα1可被激活，產生第二信使PA 來參與鹽響應過程[17，30]。林峰[12]研究表明，外施PA 可緩解植物因缺失AtPLDα1對鹽的敏感性。Yu 等[17]研究發(fā)現，鹽脅迫激活的PLDα1所產生的PA，能誘導MAPK6 激酶活性增加，進而引起下游機制響應來提高植物抗鹽性；Lee[8]研究發(fā)現用正丁醇抑制PLD活性后，MAPK 活性亦受到抑制，而外施PA 能激活MAPK 活性。本試驗結果表明，短時間NaCl脅迫處理后，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK表達量呈先升高后降低趨勢，CsPLDα表達量在處理1 h 后達最大值，而CsNMAPK表達量在處理3 h 后達最大值；兩者的蛋白表達量亦分別在處理1 h 和3 h 達最大值；PA 含量亦呈先升高后降低趨勢，在處理3 h 后達較高值，Li 等[31]研究結果與之相一致。以上結果說明，鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK基因對NaCl 脅迫響應存在時間差，且CsPLDα響應早于CsNMAPK。NO 作為一種氣體生物活性分子，在植物的生長發(fā)育和逆境信號應答過程中發(fā)揮重要功能[32]。Zhang 等[33]研究發(fā)現PLD 和PA 能夠參與NO 緩解鹽脅迫信號轉導過程；Zhang 等[34]研究表明ABA 誘導氣孔關閉信號轉導過程中，NO 位于PLDα1/PA 信號下游；同時發(fā)現NO 能夠激活葉肉細胞的PLD 活性。Raho 等[35]研究發(fā)現，植物通過PLD 和PLC/DGK 途徑產生PA 需要NO 參與。Kumar 等[36]和Clark 等[37]研究發(fā)現激活的MAPKs 級聯途徑可引發(fā)NO 大量產生，而NO 亦能激活MAPK 活性來提高煙草和擬南芥的抗病能力。本試驗結果表明，NO 可迅速被NaCl 誘發(fā)，且在處理1 h 后黃瓜幼苗葉片中NO 達最大值，與CsPLDα表達量出現最大值同步，且早于CsNMAPK信號響應。

鹽脅迫下，植物體內會產生并積累大量的氧自由基，從而引起細胞膜脂過氧化。作為植物抗氧化的第一道防線，SOD 可通過清除過剩的超氧陰離子，催化活性氧發(fā)生歧化反應產生H2O2，來提高植物的抗氧化能力[38]；而POD 和CAT 能催化H2O2與其底物反應進而分解H2O2，從而解除逆境脅迫產生的活性氧對植物的傷害[39]。本試驗結果表明，NaCl 脅迫下，黃瓜幼苗葉片中SOD 活性在3 h后達較高值，CAT、POD 和APX 活性均在5 h 后達較高值；而葉片中H2O2和O2-·含量卻隨處理時間延長呈逐漸增加趨勢。Ji 等[40]研究表明，過表達黃瓜CsPLDα可通過提高抗氧化酶SOD、POD、CAT及APX 的活性來提高煙草幼苗對NaCl 脅迫的抗性。而王靜[41]研究也發(fā)現，過表達CsNMAPK能通過增加黃瓜幼苗葉片中的NO 含量和減少葉片中的O2·-和H2O2含量來提高對高濃度NO3-的抗性。說明以上保護機制可能是由受CsPLDα介導的CsNMAPK級聯途徑來激活[42]。

4 結論

本試驗條件下，經100 mM NaCl 處理后，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 基因表達量和蛋白表達量分別在處理1 h 和3 h 達最大值，說明此兩基因表達存在時間差；PA 含量呈先升高后降低趨勢，在處理3 h 后達較高值；NO 含量在處理1 h 顯著升高；H2O2和O2-含量隨處理時間延長呈逐漸增加趨勢；SOD 活性在處理3 h 后達較高值，而CAT、POD 和APX 活性均在處理5 h 后達較高值。以上結果表明，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK基因表達對鹽響應存在時間差，且CsPLDα表達早于CsNMAPK表達。