(商洛市中心醫(yī)院急診科，陜西 商洛726000)

膿毒癥及并發(fā)休克是目前ICU患者的主要死亡原因之一[1]。感染引發(fā)的免疫反應(yīng)將炎癥因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是膿毒癥的病理基礎(chǔ)[2]。同時(shí)病原菌入侵機(jī)體釋放的內(nèi)毒素引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞中鈣濃度異常升高(鈣超載)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能受損，通透性增加，炎癥因子和病原菌可進(jìn)入組織間隙，引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)[3]。脂多糖活化Toll樣受體4(Toll-like receptor4,Tlr4)激活腫瘤壞死因子相關(guān)受體，活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，誘發(fā)炎性介質(zhì)的分泌與釋放是細(xì)菌內(nèi)毒素引發(fā)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號(hào)通路[4]。目前關(guān)于脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣超載機(jī)制尚未明確；作為體內(nèi)主要的第二信使，鈣離子的產(chǎn)生、流動(dòng)與L型鈣通道、ATP酶等多種分子通路有關(guān)[5]，但脂多糖誘導(dǎo)的Tlr4活化與細(xì)胞內(nèi)外鈣流動(dòng)相關(guān)的信號(hào)通路仍未闡明。相關(guān)研究顯示，細(xì)菌內(nèi)毒素能夠活化血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的Tlr4和髓質(zhì)分化蛋白2復(fù)合物[6]；基質(zhì)相互作用分子1(Recombinant Human Stromal Interaction Molecule 1,Stim1)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的鈣離子感受器，活化后的Stim1可激活細(xì)胞膜上的鈣池調(diào)控鈣離子通道，引發(fā)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流[7]。本研究使用脂多糖在體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，分析細(xì)胞損傷過(guò)程中Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB、Stim1、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、TNF-α的表達(dá)變化，旨在探討炎癥反應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度異常升高在膿毒癥發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)于上海斯信生物科技有限公司；Stim1抑制表達(dá)載體、Tlr4抑制表達(dá)載體由上海權(quán)陽(yáng)生物科技有限公司構(gòu)建；脂多糖、鈣離子熒光探針、NF-κB抑制劑PDTC購(gòu)于海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司；鼠抗人Stim1、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB、GAPDH單克隆抗體，山羊抗鼠IgG購(gòu)于艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，傳至5代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用濃度為1 mg/L的脂多糖刺激細(xì)胞，使用RT-PCR檢測(cè)脂多糖刺激前和刺激后1h、2h、6h、12h、24h的Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA的表達(dá)水平，引物序列由上海權(quán)陽(yáng)生物科技有限公司合成；基質(zhì)相互作用蛋白1由上海百力格生物技術(shù)有限公司完成，其中Tlr4上游：5′-AGGACACA CTTTAACAATAGGCGA-3′，下游：5′-GCAATGCGATTGATACTCCC-3′；髓質(zhì)分化蛋白2上游：5′-GTGGTTTGCACCGA ACGG TCG GG-3′，下游：5′-GGAGACTG TGTACGTCGT TAG GCG-3′；NF-κB上游：5′-TGTTAAGGCGTCG AAAA TCT-3′，下游：5′-CTATGTAACTACTCAAACCT-3′；GAPDH上游：5′-GTAG AGGTGAG TCGTTCTCCG ACC-3′，下游：5′-GAGGTTAGTTCCAACAG CCGAA-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃ 30 s。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算Stim1、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 Stim1對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣流動(dòng)的檢測(cè) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后分為空白對(duì)照組、脂多糖組、Stim1抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組，轉(zhuǎn)染2 h，加入鈣離子熒光探針室溫下反應(yīng)30 min，脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞中鈣離子濃度變化。

1.2.3 Tlr4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中鈣超載的影響

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后，分為空白對(duì)照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組、Tlr4及Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組，轉(zhuǎn)染2 h，加入鈣離子熒光探針室溫下反應(yīng)30 min，脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞中鈣離子濃度變化。

1.2.4 免疫共沉淀法分析Tlr4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Stim1、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后，分為空白對(duì)照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組，轉(zhuǎn)染12 h，脂多糖刺激6 h。RIPA提取細(xì)胞總蛋白50 μg，每組滴加1 μg Tlr4抗體，4 ℃孵育2 h，滴加Protein A/G瓊脂糖30 μL過(guò)夜，預(yù)冷的細(xì)胞裂解液洗滌后，沉淀物行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，滴加鼠抗人Stim1單克隆抗體(1∶500)，鼠抗人髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB單克隆抗體(1∶200)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫靜置2 h，ECL顯色，暗室中顯影、采集圖像并分析各條帶灰度值。

1.2.5 NF-κB對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)及Stim1、NF-κB mRNA表達(dá)的影響 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后，分為空白對(duì)照組、脂多糖組、0.1 mg/L、1 mg/L PDTC組(脂多糖與PDTC共同刺激)、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染1 h、12 h組。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、TNF-α濃度。RIPA裂解液提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測(cè)Stim1、NF-κB mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS23.0處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脂多糖刺激不同時(shí)間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達(dá)

脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2 h、6 h、12 h時(shí)Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于刺激前(P<0.05)；脂多糖刺激6 h時(shí)Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。表1，圖1，圖2。

表1 脂多糖刺激不同時(shí)間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-ΚB mRNA表達(dá)

與刺激前比較，aP<0.05(n=6)

圖1 脂多糖刺激不同時(shí)間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達(dá)變化

圖2 脂多糖刺激不同時(shí)間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達(dá)的電泳圖1：刺激前；2：刺激后1 h；3：刺激后2 h；4：刺激后6 h；5：刺激后12 h；6：刺激后24 h

2.2 Stim1對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣流動(dòng)的影響

空白對(duì)照組、脂多糖組、Stim1抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中鈣離子濃度分別為(42.68±12.31)、(110.24±19.65)、(31.55±10.07)、(63.72±12.90) nmol/L。脂多糖組鈣離子濃度明顯高于空白對(duì)照組，Stim1抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組鈣離子濃度明顯低于空白對(duì)照組，Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組鈣離子濃度明顯低于脂多糖組(P<0.01)；Stim1抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染可顯著逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。見(jiàn)圖3。

圖3 Stim1對(duì)脂多糖誘導(dǎo)各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中鈣離子濃度比較1：空白對(duì)照組；2：脂多糖組；3：Stim1抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組；4：Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組

2.3 Tlr4對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣流動(dòng)的影響

空白對(duì)照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組、Tlr4及Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中鈣離子濃度分別為(43.24±10.51)、(111.50±19.73)、(42.93±9.75)、(51.88±9.16)、(40.29±7.53) nmol/L。脂多糖組鈣離子濃度明顯高于空白對(duì)照組、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；鈣離子濃度在空白對(duì)照組與Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組、Tlr4及Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組鈣離子濃度明顯低于脂多糖組，其中Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組下降最明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.4 脂多糖誘導(dǎo)Tlr4與髓質(zhì)分化蛋白2蛋白結(jié)合

免疫共沉淀分析顯示，空白對(duì)照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組抗Tlr4抗體沉淀物中髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(2.68±0.24)、(4.41±0.56)、(1.83±0.18)。脂多糖組髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于脂多糖組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組抗Tlr4抗體沉淀物中均未檢測(cè)出Stim1、NF-κB蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖5，圖6。

圖4 Tlr4對(duì)脂多糖誘導(dǎo)各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中鈣離子濃度1：空白對(duì)照組；2：脂多糖組；3：Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組；4：Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組；5：Tlr4及Stim1抑制表達(dá)載體+脂多糖組

圖5 抗Tlr4抗體沉淀物中髓質(zhì)分化蛋白2蛋白表達(dá)1：空白對(duì)照組；2：脂多糖組；3：Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組

圖6 各組髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較1：空白對(duì)照組；2：脂多糖組；3：Tlr4抑制表達(dá)載體+脂多糖組

2.5 Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2對(duì)細(xì)胞炎性因子及細(xì)胞鈣信號(hào)的調(diào)節(jié)作用

脂多糖組IL-6、TNF-α濃度及Stim1、NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)；與脂多糖組相比，0.1 mg/L PDTC組、1 mg/L PDTC組、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染12 h組IL-6水平明顯降低(P<0.05)，而Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染1 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與脂多糖組相比，1 mg/L PDTC組TNF-α水平明顯降低(P<0.01)，而0.1 mg/L PDTC組、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染1 h及12 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1 mg/L PDTC組、Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染12 h組Stim1、NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯低于脂多糖組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2對(duì)細(xì)胞炎性因子及細(xì)胞鈣信號(hào)的調(diào)節(jié)作用

與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與脂多糖組比較，bP<0.05

3 討 論

細(xì)菌內(nèi)毒素通過(guò)與髓質(zhì)分化蛋白2特異性結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，Tlr4在此過(guò)程中具有重要作用[8-10]。相關(guān)研究顯示，體外肝素預(yù)處理后，可拮抗脂多糖誘導(dǎo)的IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子水平上調(diào)，與激活Tlr4通路有關(guān)[11-12]。本研究顯示，脂多糖可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Tlr4表達(dá)，且髓質(zhì)分化蛋白2表達(dá)水平也明顯提升，具有明顯的時(shí)間依賴(lài)性，在脂多糖刺激6 h時(shí)Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2水平達(dá)到峰值。提示細(xì)菌內(nèi)毒素通過(guò)活化細(xì)胞膜受體來(lái)發(fā)揮啟動(dòng)炎性介質(zhì)的效應(yīng)。同時(shí)脂多糖啟動(dòng)炎性介質(zhì)分泌的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也具有明顯的時(shí)間依賴(lài)性，且與Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2變化趨勢(shì)一致，提示細(xì)菌內(nèi)毒素激活炎性介質(zhì)生存的信號(hào)通路從活化受體Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2到NF-κB大量分泌具有同步性特征，為抑制細(xì)菌內(nèi)毒素炎性介質(zhì)的產(chǎn)生提供了參考。

本研究顯示，脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可引發(fā)鈣離子內(nèi)流增加，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度異常升高；下調(diào)鈣離子通道蛋白Stim1表達(dá)后可有效逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。提示Stim1可作為內(nèi)毒素引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載的作用靶點(diǎn)，特異性阻斷細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。正常生理狀態(tài)下Tlr4表達(dá)下調(diào)后對(duì)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流無(wú)明顯影響，但能夠有效逆轉(zhuǎn)脂多糖誘發(fā)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。提示脂多糖誘發(fā)的鈣超載與Tlr4明顯相關(guān)，作用機(jī)制可能與Tlr4激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有關(guān)。同時(shí)轉(zhuǎn)染Tlr4與Stim1后脂多糖誘發(fā)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流進(jìn)一步減少，提示Tlr4與Stim1可能共同介導(dǎo)了細(xì)菌內(nèi)毒素引發(fā)的鈣超載。免疫共沉淀檢測(cè)顯示，正常生理狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞中Tlr4與髓質(zhì)分化蛋白2存在相互作用，在脂多糖刺激下該作用更明顯，但能夠被Tlr4表達(dá)下調(diào)所逆轉(zhuǎn)。提示內(nèi)毒素活化Tlr4的作用與髓質(zhì)分化蛋白2明顯相關(guān)，可能通過(guò)與髓質(zhì)分化蛋白2形成復(fù)合物，活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，啟動(dòng)多個(gè)信號(hào)通路。但沉淀復(fù)合物中未檢測(cè)出Stim1、NF-κB蛋白表達(dá)，提示內(nèi)毒素Tlr4的活化未通過(guò)與Stim1、NF-κB之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，可能通過(guò)其他中間分子，仍需進(jìn)一步深入研究。

Stim1可通過(guò)感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子濃度變化，激活細(xì)胞膜上的鈣池調(diào)控鈣離子通道，引發(fā)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流[13-15]。本研究中在NF-κB抑制劑PDTC的干預(yù)下，能夠有效逆轉(zhuǎn)脂多糖上調(diào)Stim1、NF-κB表達(dá)的作用，提示Stim1表達(dá)與NF-κB明顯相關(guān)。Tlr4抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染12 h可有效下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的Stim1、NF-κB表達(dá)，提示Stim1、NF-κB可能參與調(diào)控細(xì)菌內(nèi)毒素上調(diào)Stim1表達(dá)發(fā)揮的生物學(xué)作用。NF-κB抑制劑PDTC還能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖對(duì)細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)的影響，且具有明顯的時(shí)間依賴(lài)性，提示細(xì)菌內(nèi)毒素誘發(fā)炎性介質(zhì)生成的過(guò)程中需轉(zhuǎn)錄活化因子NF-κB的參與，脂多糖可能通過(guò)作用于Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2信號(hào)通路來(lái)活化NF-κB，進(jìn)而啟動(dòng)鈣池調(diào)控鈣離子通道蛋白信號(hào)和炎性介質(zhì)信號(hào)。