薛 珊, 邢 穎, 宋華偉

薛珊, 邢穎, 陸軍第七十二集團軍醫(yī)院消化內科 浙江省湖州市 313000

宋華偉, 陸軍第七十二集團軍醫(yī)院特診科 浙江省湖州市 313000

核心提要： 化療是結腸癌的主要治療方式, 免疫抑制劑對癌癥患者起一定的作用.本研究中使用免疫抑制劑FTY720與吉西他濱聯(lián)合處理結腸癌細胞, 對結腸癌的治療可能起到一定的積極作用.

0 引言

我國結腸癌患病率和死亡率均在上升, 2015年新發(fā)37.6萬例, 死亡19.1萬例, 在我國惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率均居第5位[1].化療是大多結直腸癌患者的標準治療方法, 化療中加入生物制劑可延長患者總生存期的中位數[2].

FTY720又稱芬戈莫德, 是在器官移植和多發(fā)性硬化癥中廣泛使用的免疫調節(jié)劑.研究表明, FTY720對結腸癌細胞具有明顯的抑制作用[3].吉西他濱是一種抗腫瘤藥物, 被應用于包括結直腸癌在內的多種癌癥治療, 吉西他濱可通過激活哺乳動物Ste20樣激酶1(mammalian Ste20-like kinase 1, MST1)誘導結腸癌細胞凋亡[4].但FTY720對吉西他濱作用的結腸癌細胞的敏感性有怎樣的影響目前還不清楚.本研究發(fā)現, miR-494與MST1存在結合位點.miR-494在結直腸癌中表達上調,并可促進癌細胞增殖、遷移、侵襲等行為[5,6].本研究假設, FTY720可通過miR-494調控MST1增加結腸癌細胞對吉西他濱的敏感性.

本課題以人結腸癌細胞系SW1116為研究對象, 檢測FTY720和吉西他濱聯(lián)合使用對結腸癌細胞存活和凋亡的影響, 以及miR-494和MST1在此機制中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株SW1116購自美國模式菌種收集中心(american type culture collection, ATCC);FTY720、吉西他濱和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司; DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司; 雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司;Lipofectamine 2000轉染試劑、RNA提取試劑Trizol、實時定量聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)試劑盒、反轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司公司; CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司; 雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司; miR-494 mimics(miR-494)、miR-494抑制物(anti-miR-494)、MST1抑制劑(si-MST1)和陰性對照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)、MST1雙熒光素酶報告載體購自上海吉瑪制藥有限公司; MST1抗體、p21抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體購自美國Santacruz公司; Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司; 流式細胞儀購自美國BD公司; BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、藥物處理： SW1116細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中, 置于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 濕度保持95%.將細胞培養(yǎng)至對數生長期, 消化傳代.將細胞培養(yǎng)至貼壁后, 在培養(yǎng)液中加入終濃度為0.0001 μg/mL、0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL的吉西他濱和/或2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L的FTY720, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 收集細胞進行實驗.

1.2.2 細胞轉染： 將對數生長期的SW1116細胞用培養(yǎng)液稀釋至1×l06-2×l06個/mL, 以200 μL細胞/孔的密度接種于6孔板中, 融合度為80%-90%時進行轉染.先用無血清培養(yǎng)液稀釋脂質體、miR-NC、miR-494、anti-miRNC、anti-miR-494、si-NC、si-MST1等載體, 將脂質體和各組載體分別以體積混合, 室溫孵育20 min, 加入到培養(yǎng)好的細胞中, 混勻, 培養(yǎng)6 h, 換完全培養(yǎng)基, 轉染48 h, 收集細胞進行實驗或藥物處理.分組： miR-NC組、miR-494組、anti-miR-NC組、anti-miR-494組、si-NC組、si-MST1組.

1.2.3 qRT-PCR檢測mRNA的表達： 收集各組SW1116細胞, Trizol試劑提取細胞總RNA, 反轉錄合成cDNA,再以cDNA為模板按照Real-time PCR的說明書進行反應合成miR-494和MST1 mRNA.引物如下： miR-494上游： 5'-TGAAACATACACGGGAAACCTC-3', 下游采用通用引物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3';MST1上游： 5'-GGGTCCCAGTAGCCAAGAT-3', 下游：5'-GAGGCACCACATACCATTCA-3'; 內參U6上游引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3', 下游采用通用引物.運用2-ΔΔCt方法進行數據分析.

1.2.4 CCK8實驗檢測細胞存活率和半數抑制濃度： 收集FTY720和/或吉西他濱處理24 h后的SW1116細胞,0.25%胰蛋白酶消化, 培養(yǎng)液稀釋細胞以2×103個/孔(100 μL細胞)接種于96微孔板中, 加入10 μL CCK8溶液,培養(yǎng)2 h, 酶標儀測定450 nm吸光度(Absorbance value, A)值.細胞存活率 = 實驗組A值/對照組A值×100%.抑制率% = (對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%.以藥物濃度和抑制率分別為橫軸和縱軸, 繪制濃度效應曲線, 計算半數抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50).

1.2.5 流式細胞術測定細胞凋亡率： 將SW1116細胞以2×105個/孔接種于6孔板中, 培養(yǎng)24 h (細胞貼壁), 然后用FTY720和/或吉西他濱處理24 h, 消化收集細胞, 按照凋亡試劑盒說明書進行操作, 加入5 μL膜聯(lián)蛋白標記的V-FITC和5 μL碘化丙啶, 混勻后室溫避光20 min, 流式細胞儀檢測凋亡率.

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗： SW1116細胞轉染48 h, 收集細胞, Trypsin消化, 計數, 以1×104個細胞/孔接種于24孔板中, 培養(yǎng)24 h , 觀察若細胞融合度達到80%-90%, 進行轉染, 分別構建MST1的野生型(WT-MST1)和突變型(MUT-MST1)雙熒光素酶報告載體, 將報告載體分別與miR-NC或miR-494共轉染SW1116細胞, 轉染后培養(yǎng)48 h, 裂解細胞, 根據試劑盒檢測熒光素酶活性.以海腎熒光素酶活性為內參照, 計算相對螢火蟲熒光素酶活性.

1.2.7 Western blot實驗： 將轉染48 h后的各組SW1116細胞用RIPA裂解液裂解, 超聲破碎細胞, 收集蛋白.將蛋白樣本進行SDS-PAGE, 轉膜, 封閉1 h, 加入一抗(MST1：1：1000, p21： 1：2000, Caspase-3： 1：2000), 4 ℃孵育過夜.洗膜2次, 然后加入的二抗(1：1000), 室溫孵育1 h.以GAPDH為內參照, 分析蛋白水平.

統(tǒng)計學處理結果均以mean±SD表示, 數據采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析, 采用獨立樣本t檢驗和單因素方差進行分析.以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 FTY720和吉西他濱對人結腸癌SW1116細胞存活率的影響 與0 μg/mL濃度的吉西他濱(100.11%±10.02%)相比, 0.0001 μg/mL、0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL的吉西他濱處理的結腸癌SW1116細胞的存活率(95.14%±9.26%、86.84%±8.73%、0.16%±7.14%、54.18%±5.27%、37.68%±3.59%)逐漸降低, 具有劑量依賴性, 計算得IC50 = 0.1024 μg/mL, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); 與0 μmol/L的FTY720 (100.01%±10.01%)相比, 2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L的FTY720處理的結腸癌SW1116細胞的存活率(87.67%±8.37%、71.34%±7.25%、64.30%±6.51%、48.28%±4.56%、39.97%±4.03%)逐漸降低, 具有劑量依賴趨勢, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 計算得IC50 = 8.625 μg/mL (表1、表2).根據結果, 后期實驗選用存活率約為50%的吉西他濱濃度0.1 μg/mL, FTY720濃度10 μmol/L.

2.2 FTY720和吉西他濱對SW1116細胞存活率凋亡及miR-494、MST1表達的影響 與對照組相比, 吉西他濱組和FTY720組的SW1116細胞中miR-494的含量均降低(P＜0.05), MST1、p21和Caspase-3蛋白表達量均升高, 細胞存活率均降低(P＜0.05), 細胞凋亡率均上升(P＜0.05); 吉西他濱+FTY720組結果與吉西他濱組和FTY720組結果趨勢一致, 且效果更顯著(圖1、表3).說明兩者聯(lián)合使用可抑制SW1116細胞存活并促進細胞凋亡, 且比單獨使用效果更好.

2.3 過表達miR-494能逆轉FTY720、吉西他濱對細胞SW1116細胞存活率凋亡的影響 與吉西他濱+FTY720+miR-NC組相比, 吉西他濱+FTY720+miR-494組SW1116細胞的miR-494含量升高(P＜0.05), p21和Caspase-3表達顯著降低(P＜0.05), 細胞存活率升高(P＜0.05), 凋亡率下降(P＜0.05)(圖2、表4、表5).說明過表達miR-494可逆轉FTY720、吉西他濱對SW1116細胞存活率和凋亡的作用.

2.4 miR-494靶向調控MST1 Targetscan預測結果顯示,MST1的3'-UTR序列中含有與miR-494互補的位點(圖3A).雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果如表6所示, 與miR-NC組相比, miR-494組野生型WT-MST1的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P＜0.05); 而突變型MUT-MST1的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化.Western blot結果發(fā)現,過表達miR-494組的MST1mRNA和蛋白表達量顯著下降(P＜0.05); miR-494抑制組的MST1 mRNA和蛋白表達量均顯著上升(P＜0.05)(圖3B、表7).

2.5 抑制MST1可逆轉FTY720和吉西他濱作用的細胞SW1116的細胞存活率及凋亡的影響 與吉西他濱+FTY720組和吉西他濱+FTY720+si-NC組相比, 吉西他濱+FTY720+si-MST1組的SW1116細胞中MST1 mRNA含量降低(P＜0.05), p21和Caspase-3表達顯著降低(P＜0.05), 細胞存活率升高(P＜0.05), 凋亡率下降(P＜0.05)(圖4、表8).說明抑制MST1可逆轉FTY720和吉西他濱對SW1116細胞存活率和凋亡的影響.

3 討論

FTY720是臨床批準的多發(fā)性硬化癥免疫調節(jié)劑, 通過鞘氨醇-1-磷酸1受體的功能拮抗作用將T細胞隔離于淋巴結, 有研究表明[7]其在腫瘤的化療中也可發(fā)揮作用.FTY720可增強卡鉑和它莫西芬在卵巢癌患者來源的異種移植模型中的抗腫瘤活性[8]; FTY720可抑制基底樣乳腺癌生長[9]并增強膠質母細胞瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[10].有研究表明[11], FTY720對結直腸癌細胞也有毒性作用.吉西他濱用于治療結腸癌、肺癌、卵巢癌、肝膽系統(tǒng)腫瘤等腫瘤, 且效果良好[12,13].FTY720在吉西他濱對結腸癌的治療中是否有輔助作用, 目前尚不完全清楚.

本研究通過用不同濃度的FTY720和吉西他濱分別或聯(lián)合處理結腸癌SW1116細胞發(fā)現, FTY720和吉西他濱均可抑制結腸癌細胞SW1116的存活并促進細胞凋亡, 細胞存活率約為50%時吉西他濱濃度為0.1 μg/mL,FTY720濃度為10 μmol/L, 且兩者聯(lián)合使用對SW1116細胞的抑制作用更強.說明FTY720對吉西他濱抗結腸癌治療具有促進作用, 但具體機制尚不清楚.

有研究表明[4], 吉西他濱可通過激活MST1并與親環(huán)素D形成線粒體復合物促進結腸癌細胞的死亡.而本研究通過生物信息學預測發(fā)現, miR-494與MST1的3'UTR區(qū)存在互補序列, 推測MST1可能是miR-494的靶基因.因此, 本研究假設, FTY720可能通過miR-494靶向MST1促進吉西他濱對SW1116細胞的抑制作用.

MST1是一種促凋亡激酶, 是凋亡信號傳導和細胞功能障礙的關鍵介質, 其過表達可引起細胞的持續(xù)凋亡, 其缺失可導致嚴重的免疫缺陷, MST1在腦及心肌缺血再灌注損傷、糖尿病、器官大小控制及腫瘤抑制中起著重要作用[14-17].Hippo通路在癌癥中發(fā)揮其獨特的致瘤能力, 而MST1是Hippo通路的核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)之一, 因此MST1通過Hippo通路參與對腫瘤的調控過程, 其過表達可抑制腫瘤細胞增殖和存活[18].MST1在胰腺導管癌(PDAC)和非小細胞肺癌A549細胞中均表達下調, 其過表達可降低細胞活力并促進細胞死亡, MST1過表達與線粒體呼吸功能受損和細胞能量代謝受抑制密切相關[19,20].MST1在結直腸癌中也表達下調, 其過表達可誘導癌細胞凋亡并抑制細胞增殖和遷移[21].本研究結果發(fā)現, FTY720和吉西他濱均可促進MST1 mRNA和蛋白的表達, 抑制細胞存活并促進細胞凋亡, 抑制MST1可逆轉FTY720和吉西他濱對SW1116細胞存活和凋亡的作用, 說明FTY720通過促進MST1抑制結腸癌.

表1 吉西他濱對結腸癌SW1116細胞存活率的影響(mean±SD, n = 9)

表2 FTY720對SW1116細胞存活率的影響(mean±SD, n = 9)

表3 FTY720能增強吉西他濱對細胞SW1116細胞存活率凋亡及miR-494、MST1表達的影響(mean±SD, n = 9)

表4 過表達miR-494(mean±SD, n = 3)

表5 過表達miR-494能逆轉FTY720、吉西他濱對細胞SW1116細胞存活率凋亡的影響(mean±SD, n = 9)

表6 雙熒光素酶報告實驗(mean±SD, n = 9)

圖1 FTY720、吉西他濱對SW1116細胞增殖凋亡及MST1、p21、Caspase-3蛋白表達的影響.A: FTY720、吉西他濱對細胞SW1116細胞凋亡的影響; B: FTY720、吉西他濱對細胞SW1116細胞增殖的影響; C: MST1、p21、Caspase-3蛋白的表達; D: miR-494的表達.PI: 碘化丙啶.

表7 miR-494調控MST1的表達(mean±SD, n = 9)

表8 抑制MST1可逆轉FTY720和吉西他濱作用的SW1116的細胞存活率及凋亡的影響(mean±SD, n = 9)

圖2 過表達miR-494能逆轉FTY720、吉西他濱對細胞SW1116凋亡及MST1、p21、Caspase-3蛋白表達的影響.A: 過表達miR-494能逆轉FTY720、吉西他濱對細胞SW1116細胞凋亡的影響; B: MST1、p21、Caspase-3蛋白的表達.PI: 碘化丙啶.

圖3 miR-494靶向、調控MST1.A: MST1的3'UTR含有miR-494的互補序列; B: MST1蛋白的表達.

圖4 抑制MST1可逆轉FTY720和吉西他濱作用的細胞SW1116凋亡及MST1、p21、Caspase-3蛋白表達的影響.A: 抑制MST1可逆轉逆轉FTY720、吉西他濱對細胞SW1116細胞凋亡的影響; B: MST1、p21、Caspase-3蛋白的表達.PI: 碘化丙啶.

miR-494在結腸癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)耐藥細胞系中表達下調, 通過調節(jié)DPYD表達增強結腸癌細胞對5-Fu的敏感性[22].本研究證實了, FTY720和吉西他濱均可抑制SW1116細胞中miR-494的表達, 過表達miR-494可逆轉FTY720、吉西他濱對SW1116細胞存活率和凋亡的作用.通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Western blot結果發(fā)現, miR-494靶向負調控MST1的表達, 間接證實兩者的調控關系.

綜上所述, 本研究闡述了, 在結直腸癌SW1116細胞中, FTY720和吉西他濱通過下調miR-494靶向促進MST1的表達, 進而抑制SW1116細胞存活, 促進細胞凋亡, 從而達到治療結直腸癌的目的.FTY720具有增強結直腸癌對吉西他濱敏感性的作用.

文章亮點

實驗背景

結腸癌患者確診時多為中晚期, 化療是其主要治療方式.FTY720是一種作用機制獨特的免疫抑制劑,可用于器官移植、自體免疫疾病、腫瘤和炎癥等疾病的治療.研究表明, FTY720聯(lián)合化療藥物在癌癥中起到積極作用, 本研究采用FTY720聯(lián)合吉西他濱處理結腸癌細胞, 并探討兩者對結腸癌細胞的抑制作用和機制.

實驗動機

本研究中使用到的是吉西他濱, 它是目前治療結腸癌的有效藥物之一; FTY720對結腸癌細胞也具有一定的毒性作用, 兩者聯(lián)合使用可能對患者的健康有一定的積極意義.

實驗目標

提高吉西他濱對結腸癌細胞的抑制作用, 探討其對結腸癌的抑制機制.

實驗方法

本篇論文為了達到目標采用了細胞轉染、實時定量聚合酶鏈式反應、CCK8法、流式細胞術、Western blot和雙熒光素酶報告實驗的方法, 同時進行數據比較時選擇獨立樣本t檢驗進行兩組間比較, 單因素方差進行多組間比較.

實驗結果

選取抑制率約為50%的0.1 μg/mL吉西他濱和10 μmol/L的FTY720進行實驗, 吉西他濱和FTY720均可抑制細胞存活并促進細胞凋亡, 且聯(lián)合使用比單獨使用效果更好; 過表達miR-494可逆轉FTY720、吉西他濱對SW1116細胞存活率和凋亡的作用; miR-494靶向調控MST1; 抑制MST1可逆轉FTY720和吉西他濱對SW1116細胞存活率和凋亡的影響.

實驗結論

根據實驗結果, 得出吉西他濱和FTY720可能通過調控miR-494/MST1途徑抑制結腸癌細胞增殖, 促進細胞凋亡, 達到抑制結腸癌的目的.

展望前景

吉西他濱和FTY720的聯(lián)合使用在結腸癌的臨床治療中具有潛在的應用價值.