王 亮, 張 龍, 石 偉

王亮, 天津市第五中心醫(yī)院藥劑科 天津市 300450

張龍, 石偉, 河北醫(yī)科大學(xué)藥理組 河北省石家莊市 050017

核心提要： 本研究首次證實KCNQ1OT1在胃癌(gastric cancer, GC)細(xì)胞中呈高表達(dá), 抑制KCNQ1OT1表達(dá)可抑制GC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲, 還可增強順鉑敏感性.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一種臨床常見的消化系統(tǒng)腫瘤, 在全世界仍然是一個相當(dāng)大的健康負(fù)擔(dān)[1].盡管, 我國GC的發(fā)病率已趨于平穩(wěn), 但總發(fā)病人數(shù)還在不斷增加[2].目前, 以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療仍是GC中晚期患者常用的治療手段, 但化療藥物的長期或不規(guī)范使用會產(chǎn)生耐藥抵抗, 導(dǎo)致治療效果不太理想[3].因此, 深入探討GC發(fā)生發(fā)展的分子機制, 尋找有效提高腫瘤細(xì)胞對鉑類化療藥物敏感性的方法具有重要意義.越來越多的研究[4-6]顯示, 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通過調(diào)控基因表達(dá)在GC發(fā)生發(fā)展和耐藥形成過程中發(fā)揮著重要作用.lncRNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1 overlapping transcript 1, KCNQ1OT1)定位于人11p15.5染色體上, 是KCNQ1的反義鏈轉(zhuǎn)錄物, 被報道與結(jié)直腸癌和卵巢癌等腫瘤惡性進展和順鉑耐藥密切相關(guān)[7,8].有學(xué)者[9,10]指出, 在GC組織和細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)上調(diào), 且高表達(dá)KCNQ1OT1與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān), 但其在GC中的作用并不清楚.本研究通過觀察下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對HGC-27細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和順鉑敏感性的影響, 旨在揭示KCNQ1OT1在GC發(fā)生發(fā)展中的作用, 以期為GC的治療提供新線索.

1 材料和方法

1.1 材料 HGC-27細(xì)胞(美國ATCC), 細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)(北京百奧生物), RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone), 胎牛血清(杭州四季青), 細(xì)胞周期檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇南京凱基),順鉑(美國Sigma), 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL發(fā)光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE配膠試劑盒(上海碧云天), 上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體和山羊抗兔或鼠HRP標(biāo)記的IgG二抗(美國Santa Cruz),Trizol試劑和Lipofectamine 2000(美國Invitrogen), 靶向KCNQ1OT1的小干擾RNA KCNQ1OT1-siRNA(UGAG CGUAGCAUCGAGAGCGUACGUCGAUCGAC)及其陰性對照NC-siRNA(上海吉瑪).Matrigel和FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD), Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific), Transwell小室(美國Corning),BB15二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo), ProFlexTM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)儀(美國ABI), ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad).

我院圍手術(shù)期質(zhì)子泵抑制劑使用情況調(diào)查及合理性評價…………………………………………………… 馬志會等（12）：1715

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理： HGC-27細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng).將對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞以每孔2×105個接種至6孔細(xì)胞板上后, 常規(guī)培養(yǎng)約至70%融合度時, 參照Lipofectamine 2000說明書步驟進行瞬時轉(zhuǎn)染.將轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1-siRNA的細(xì)胞作為KCNQ1OT1-siRNA組, 轉(zhuǎn)染NC-siRNA的細(xì)胞作為NC-siRNA組, 以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組.轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集對照組、NC-siRNA組和KCNQ1OT1-siRNA組細(xì)胞并采用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)法檢測各組細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果.另外, 將轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1-siRNA后給予順鉑處理48 h的細(xì)胞, 通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力, 并計算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half- maximal inhibitory concentration, IC50)值[11].

1.2.2 qRT-PCR檢測KCNQ1OT1表達(dá)： 采用Trizol法提取HGC-27細(xì)胞總RNA后, 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.以cDNA為模板, 在20 μL反應(yīng)體系下根據(jù)設(shè)定的PCR反應(yīng)條件(94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s, 循環(huán)40次)上PCR儀進行擴增.以GAPDH為管家基因, 采用2-△△Ct法計算HGC-27細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)水平.其中, 由上海生工生物工程合成的PCR引物序列如下：KCNQ1OT1上游： 5'-CCTCCCTCACTGAGCTTTGG-3',下游： 5'-GTGCGGACCCTATACGGAAG-3'; GAPDH上游： 5'-GCTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3', 下游：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'.

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖： 收集轉(zhuǎn)染48 h后的NC-siRNA組、KCNQ1OT1-siRNA組和對照組HGC-27細(xì)胞, 按照每孔105個接種至96孔細(xì)胞板上, 其中每組設(shè)置3個復(fù)孔; 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后, 棄培養(yǎng)液, 每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h.采用酶標(biāo)儀檢測HGC-27細(xì)胞在450 nm處的吸光度(optical density, OD)值, 實驗重復(fù)3次.

1.2.4 Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移： (1)侵襲實驗： 將50 μL Matrigel均勻地鋪在(濃度為500 ng/μL)Transwell小室內(nèi)面上, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h使其凝固.向24孔細(xì)胞板中每孔加入含血清培養(yǎng)基600 μL, 將Transwell小室放入24孔細(xì)胞板中, 并在小室上室中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液(濃度為105個/mL); 放入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后, 將小室取出.以棉簽小心拭去上室面殘留的細(xì)胞后, 將小室放入4%多聚甲醛固定液中固定30 min; 再以0.1%結(jié)晶紫染色15 min后, 采用顯微鏡觀察統(tǒng)計各組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù), 結(jié)果以隨機選取的3個視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)的均值表示.實驗重復(fù)3次; (2)遷移實驗：Transwell小室不需藥使用Matrigel鋪蓋, 其余不同與侵襲實驗相同.

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期： 收集轉(zhuǎn)染48 h后的NC-siRNA組、KCNQ1OT1-siRNA組和對照組HGC-27細(xì)胞, 加入預(yù)冷的70%乙醇溶液在-20 ℃下孵育24 h.棄上清后, 加入0.1 mL RNase(濃度5 μg/mL)和0.5 mL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)(濃度50 μg/mL)于37 ℃下避光反應(yīng)30 min.采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布情況.

1.2.6 免疫印跡法檢測細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、P-糖蛋白、多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白1蛋白表達(dá)： 將HGC-27細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白后, 采用BCA法檢測總蛋白的濃度與純度.將變性后的蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠中行電泳分離.電泳結(jié)束后, 轉(zhuǎn)PVDF膜.以5%脫脂奶粉封膜2 h后, 加入E-cadherin(1：800)、N-cadherin(1：800)、Vimentin(1：1000)、P-gp(1：1000)、MRP1(1：1000)和GAPDH(1：1000)抗體于4 ℃下孵育24 h.再以HRP標(biāo)記的IgG二抗(1：5000)室溫孵育2 h后, 加入ECL顯影曝光.以GAPDH為內(nèi)參, 采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析HGC-27細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平.實驗重復(fù)3次.

統(tǒng)計學(xué)處理實驗所得數(shù)據(jù)以mean±SD形式表示,采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析, 多組間比較使用單因素方差分析, 組間多重比較采用SNK-q, 兩組間比較采用獨立樣本t檢驗.P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后HGC-27細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá) 與對照組比較, NC-siRNA組細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); 與NC-siRNA組或?qū)φ战M比較,KCNQ1OT1-siRNA組細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)(圖1).

2.2 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對HGC-27細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較, NC-siRNA組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); 與對照組或NC-siRNA組比較, KCNQ1OT1-siRNA組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h、72 h和96 h后增殖活力明顯降低(P＜0.05)(圖2).

2.3 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對HGC-27細(xì)胞周期的影響 與對照組比較, NC-siRNA組細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期所占百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); 與對照組或NC-siRNA組比較, KCNQ1OT1-siRNA組細(xì)胞在G0/G1期所占百分比明顯升高, 而在S期和G2/M期所占百分比明顯降低(P＜0.05)(圖3).

2.4 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對HGC-27細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與對照組比較, NC-siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); 與對照組或NC-siRNA組比較, KCNQ1OT1-siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目均明顯減少(P＜0.05)(圖4).

2.5 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對HGC-27細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 與對照組比較, NC-siRNA組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); 與對照組或NC-siRNA組比較, KCNQ1OT1-siRNA組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高, 而N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)(圖5).

2.6 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對HGC-27細(xì)胞順鉑耐藥性的影響 與NC-siRNA組比較, KCNQ1OT1-siRNA組P-gp蛋白水平顯著降低(P＜0.05), MRP1蛋白水平顯著升高(P＜0.05), IC50值明顯降低(P＜0.05)(圖6).

3 討論

lncRNA是一類可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的長鏈非編碼RNA, 不具備編碼蛋白的功能, 在維持基因穩(wěn)定性和促進DNA修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用[12].研究[13-15]顯示, 在GC組織或細(xì)胞中存在異常表達(dá)的lncRNA, 并且這些lncRNA可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為參與GC的發(fā)生發(fā)展和耐藥形成.

KCNQ1OT1是lncRNA成員, 其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸引起關(guān)注.KCNQ1OT1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào), 且其表達(dá)水平與患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存率縮短有關(guān), 被認(rèn)為是結(jié)腸癌獨立預(yù)后指標(biāo)[16].在膀胱癌中KCNQ1OT1發(fā)揮著原癌基因的作用, 敲低KCNQ1OT1表達(dá)可通過調(diào)控miR-145-5p/PCBP2軸抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移并促進細(xì)胞凋亡[17].此外, KCNQ1OT1高表達(dá)還與腫瘤化療耐藥有關(guān).在抗奧沙利鉑肝癌細(xì)胞KCNQ1OT1表達(dá)上調(diào), 敲低KCNQ1OT1除了可通過調(diào)控miR-7-5p/ABCC1表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移外, 還可通過降低耐藥基因MRP5、MDR1和LRP1表達(dá)降低腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥抵抗[18]; KCNQ1OT1可通過靶向調(diào)控miR-211-5p表達(dá)促進舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖并抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡, 而敲低其表達(dá)可挽救腫瘤細(xì)胞的順鉑抵抗, 被認(rèn)為是舌鱗狀細(xì)胞癌治療的新靶點[19].

圖1 各組細(xì)胞中長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1表達(dá)水平的比較.與對照組或NC-siRNA組比較, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1.

圖2 各組細(xì)胞增殖活力的比較.與對照組或NC-siRNA組比較,aP＜0.05.KCNQ1OT1: 長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1; OD:吸光度.

圖3 各組細(xì)胞周期分布比較.與對照組或NC-siRNA組比較,aP＜0.05.KCNQ1OT1: 長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1.

圖4 各組中侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目的比較.與對照組或NC-siRNA組比較, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1; Migration: 細(xì)胞遷移數(shù)量; Invasion: 細(xì)胞侵襲數(shù)量.

KCNQ1OT1在GC組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)異常高表達(dá),且其表達(dá)水平的改變與患者不良預(yù)后密切相關(guān), 但其在GC細(xì)胞生長和順鉑耐藥抵抗中的作用并不清楚.GC的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多階段和多基因調(diào)控的復(fù)雜過程, 其中細(xì)胞周期失調(diào)導(dǎo)致的惡性增殖是GC發(fā)生發(fā)展的重要機制[20].本研究下調(diào) KCNQ1OT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn), HGC-27細(xì)胞增殖能力明顯減弱; 同時, HGC-27細(xì)胞在G0/G1期所占百分比明顯升高, 在S期和G2/M期所占百分比明顯減少.結(jié)果表明, 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期抑制GC細(xì)胞增殖.此外, 侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征[21], 而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮來源腫瘤細(xì)胞獲得侵襲能力的重要環(huán)節(jié), 與GC細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[22-23].本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào) KCNQ1OT1表達(dá)還可使HGC-27細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)升高, 而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低, HGC-27細(xì)胞侵襲和遷移能力減弱.結(jié)果表明, 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)可通過抑制GC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移.提示,KCNQ1OT1可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和遷移在GC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的促癌作用.順鉑是GC化療是常用藥物之一, 但化療過程中易產(chǎn)生耐藥; 而靶向調(diào)控基因表達(dá)可增強順鉑對細(xì)胞的敏感性, 降低其耐藥抵抗, 有望成為GC化療的增敏劑[24-25].本研究以靶向干擾KCNQ1OT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn), 順鉑IC50值顯著降低, P-gp蛋白水平降低, MRP1蛋白水平升高, 說明下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)可提高順鉑對GC細(xì)胞的敏感性.提示,KCNQ1OT1在GC化療耐藥過程中發(fā)揮著重要作用, 而靶向干擾KCNQ1OT1表達(dá)可能是改善GC化療耐藥的重要策略.

綜上所述, 下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)可抑制HGC-27細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并增強細(xì)胞對順鉑的敏感性.本研究初步揭示了KCNQ1OT1在GC中的作用, 其具體的作用機制還需進一步深入探討.

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer, GC)是臨床常見的惡性腫瘤, 其發(fā)病率與死亡率逐年上升, 目前關(guān)于GC發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機制尚未闡明, 因而探尋轉(zhuǎn)移相關(guān)基因?qū)沂綠C發(fā)生及發(fā)展的分子機制具有重要意義.

實驗動機

臨床主要采用手術(shù)結(jié)合放化療的方式進行治療, 但患者極易產(chǎn)生耐藥性, 因而探究GC細(xì)胞耐藥性機制有助于提高治療效果及改善患者預(yù)后.

圖5 免疫印跡法檢測上皮型鈣黏蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá).與對照組或NC-siRNA組比較, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1; E-cadherin: 上皮型鈣黏蛋白; N-cadherin: 神經(jīng)型鈣黏蛋白; Vimentin: 波形蛋白; GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

圖6 下調(diào)長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1表達(dá)對胃癌HGC-27細(xì)胞順鉑耐藥性的影響.A: Western Blot檢測P-糖蛋白、多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白1的表達(dá); B: 各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度比較.與對照組比較, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1; P-gp: P-糖蛋白;MRP1: 多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白1; GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脫氫酶; IC50: 半數(shù)抑制濃度.

實驗?zāi)繕?biāo)

探討下調(diào)長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1 opposite strand/antisense transcript 1, KCNQ1OT1)表達(dá)對GC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響及分子機制, 并探討細(xì)胞對順鉑的敏感性.

實驗方法

采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測GC細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá), MTT檢測細(xì)胞增殖, Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲, Western blot法檢測細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá).檢測IC50值及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)從而探究KCNQ1OT1對細(xì)胞耐藥性的影響及其作用機制.

實驗結(jié)果

KCNQ1OT1在GC細(xì)胞中呈高表達(dá), 抑制KCNQ1OT1表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲, 還可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯, 同時抑制KCNQ1OT1表達(dá)可增強細(xì)胞敏感性.

實驗結(jié)論

抑制KCNQ1OT1表達(dá)可抑制GC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并增強細(xì)胞對順鉑的敏感性.

展望前景

KCNQ1OT1可能作為GC診斷及治療的潛在靶點, 還可能為GC敏感性藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ).