王李瑤，孫 龍，毛加榮，霍黎生

陜西省中醫(yī)醫(yī)院（西安710003）

近年來隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們工作方式，飲食結(jié)構(gòu)的變化，功能性便秘（Functional constipation，F(xiàn)C）的發(fā)病率越來越高，F(xiàn)C是指由非器質(zhì)性原因引起的無法排便或排便困難相關(guān)的腹部病癥，并通過排糞造影，結(jié)腸鏡，腸道鋇劑灌腸或甲狀腺功能檢測等相關(guān)影像學(xué)或?qū)嶒炇覚z查，排除其他原因造成的繼發(fā)出現(xiàn)的便秘癥侯群［1］。結(jié)合肛門直腸動力和感覺功能的特點將FC大致分為以下三類［2］：①慢傳輸型便秘（Slow transit constipation，STC），②出口梗阻型便秘（Outlet obstructive constipation，OOC），③ 混 合 型 便 秘（Mixed constipation，MC ）。其中，出口梗阻型便秘（OOC）是指盆底組織、器官的結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變，導(dǎo)致排便困難或羈留性便秘綜合征，慢性便秘一種，發(fā)病率高，女性高于男性［3］。直腸前突、直腸黏膜脫垂、直腸內(nèi)套疊是主要病因［4］。

直腸黏膜脫垂又稱直腸內(nèi)套疊，是指直腸黏膜與肌層間結(jié)締組織過于松弛，黏膜層下移，是引起出口梗阻型便秘的原因之一，為直腸本身的一種退行性改變［5］。我們的研究將集中于以直腸黏膜脫垂為主要病因的OOC病例。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial cells of Cajal，ICCs）是西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家 Cajal于1893年觀察到的一種非神經(jīng)但又與神經(jīng)密切相關(guān)的特殊細(xì)胞，是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞（Pacemaker cells），并參與慢波的傳播，對腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)信息傳遞具有重要的調(diào)控作用［6］。在光鏡下，ICCs呈紡錘狀或星狀，核大，幾乎所有的ICCs都表達CD117，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對CD117進行標(biāo)記，可在光鏡水平觀察ICCs形態(tài)和分布特點［7］。Hagger等發(fā)現(xiàn)巨結(jié)腸標(biāo)本縱行肌，環(huán)形肌，平滑肌間ICCs密度明顯下降［8］，Adachi［9］等對4列乙狀結(jié)腸巨結(jié)腸患者腸標(biāo)本進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肌肉結(jié)構(gòu)未見明顯組織學(xué)改變，但是表達CD117的ICCs是減少的，因此指出：CD117陽性ICCs表達下調(diào)可能是導(dǎo)致巨結(jié)腸的重要因素。關(guān)于ICCs在OOC方面的研究報道極少，而ICCs在OOC病患病灶處的結(jié)構(gòu)形態(tài)分布特點還未見報道。

本實驗利用通過免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記CD117，觀察以直腸黏膜脫垂為主要病因的梗阻性便秘（OOC）患者相對于混合痔患者直腸肌壁的黏膜層、黏膜下層和肌層中Cajal間質(zhì)細(xì)胞的異常變化，從而推斷腸神經(jīng)系統(tǒng)在OOC中的調(diào)控作用。

材料與儀器

1 主要試劑 一抗：CD117免疫組化試劑 （中杉金橋），通用型二抗（安必平），DAB顯色試劑盒（邁新生物），0.1mol／L檸檬酸鹽緩沖液（邁新生物），100%、95%、80%乙醇（天津瑞金），二甲苯（天津瑞金），蘇木素染液（貝索），中性樹膠（上海懿洋）。

2 儀器與設(shè)備 電子顯微鏡（奧林巴斯公司），圖像采集系統(tǒng)（奧林巴斯公司），超聲波清洗器KQ3200DA（昆山蘇美），F(xiàn)A1004A分析天平（上海精天電子儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），－20～4℃低溫冰箱（Hair公司），18cm不銹鋼高壓鍋（沈陽壓力國廠），數(shù)字顯示移液器（芬蘭GILSON公司），黏附載玻片（福州邁新）。

3 標(biāo)本的獲取 依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，對符合條件的患者查隨機數(shù)字表法選取72例，產(chǎn)生隨機序列。信封法對納入的患者查隨機數(shù)字表法分為OOC組（36例）、對照組（36例）。采取手術(shù)方式為改良TST切除術(shù)，切取OOC組及對照組患者經(jīng)排糞造影證實有直腸黏膜脫垂段直腸腸壁，術(shù)中腸管標(biāo)本取下后切取全層肌壁組織。

4 標(biāo)本處理 標(biāo)本取下后經(jīng)PBS緩沖液沖洗后置于4%多聚甲醛中固定24h后經(jīng)修整取材，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋后制成石蠟標(biāo)本，應(yīng)用輪轉(zhuǎn)式切片機切片，溫水漂浮法撈片，烤干備用。

5 蘇木素及伊紅染色 將切片依次放入二甲笨透明及梯度乙醇溶液中進行醇化后入蘇木素染液中10min，伊紅染液3min后脫水、透明與封片。

6 免疫組化染色 將切片依次放入二甲笨透明及梯度乙醇溶液中進行醇化后高壓蒸汽修復(fù)10min，3%甲醇雙氧水阻斷后滴加一抗（CD117）及二抗，然后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水等步驟最后透明封片。

7 顯微鏡下觀察計數(shù) 應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察，以結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景，在相應(yīng)部位胞膜和胞漿著色，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性，無著色或著色強度與背景無差異為陰性，同一切片中隨機取10個高倍鏡視野（10×40倍）并計數(shù)黏膜固有層、黏膜下層及肌層中不同部位中CD117陽性細(xì)胞數(shù)量并觀察細(xì)胞的形態(tài)改變。然后在電腦中使用IPP6.0軟件進行細(xì)胞計數(shù)及灰度值分析。

8 統(tǒng)計學(xué)方法 選用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，檢驗方法為兩樣本獨立t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

顯微鏡下觀察到，與對照組相比較，OOC組患者直腸腸壁中肌層和黏膜下層中的CD117陽性表達細(xì)胞是明顯減少。正常Cajal間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)應(yīng)為紡錘狀或星狀，而本研究OOC組中，細(xì)胞染色較正常變?nèi)?，形態(tài)變圓鈍，形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)變少，而在黏膜固有層中的CD117陽性的表達的細(xì)胞幾乎不變甚至是增加的，細(xì)胞形態(tài)也沒有明顯變化（圖1）。人工計數(shù)和免疫組化分析軟件觀察CD117在患者黏膜層和黏膜下層中的表達的定量結(jié)果，見表1、2。

表1 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的計數(shù)比較（±s，個）

表1 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的計數(shù)比較（±s，個）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05

分 組 黏膜固有層 黏膜下層 肌層OOC組 16.02±0.61 28.78±0.62△ 10.44±0.66△對照組 7.55±0.69 40.96±0.63 15.24±0.68

表2 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的IOD值差異比較（±s，個）

表2 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的IOD值差異比較（±s，個）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05

分 組 黏膜固有層 黏膜下層 肌層OOC組 32.02±0.53 8.78±0.63△ 5.25±0.87△對照組 27.55±0.89 17.96±0.78 12.44±0.56

圖1 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的表達差異

討 論

目前，關(guān)于OOC的相關(guān)發(fā)病機制還都探索中，其中之一就是關(guān)于肛門直腸動力改變及感覺功能障礙等學(xué)說［10］，某些神經(jīng)性疾病可引起相應(yīng)神經(jīng)支配肌肉的不協(xié)調(diào)性收縮。正常排便過程依賴于高度協(xié)調(diào)的感受和運動機制，其涉及自主神經(jīng)系統(tǒng)，腸神經(jīng)系統(tǒng)和依賴軀體神經(jīng)的相互作用與盆底肌肉活動的順序變化，該途徑的任何部分的損害都將導(dǎo)致某種形式的便秘［11］。隨著神經(jīng)腸胃病學(xué)的發(fā)展，將在神經(jīng)、細(xì)胞和分支層次進一步闡明控制腸道功能之間的相互關(guān)系［12］。例如Bassotti等研究發(fā)現(xiàn)，OCC患者黏膜下神經(jīng)叢中的神經(jīng)元明顯減少，在肌間神經(jīng)叢中數(shù)量正常，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在兩種神經(jīng)叢中都減少［13］。又如崔華勤等通過對885例病人檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，53例恥骨肌肥厚癥的病人，48例肌電圖表現(xiàn)明顯異常，31例盆底痙攣綜合征病人中，29例表現(xiàn)明顯異常［14］。通過以上研究我們初步推斷，OOC的病因與直腸肌壁的神經(jīng)電生理改變密切相關(guān)，而引起這種動力異常的深部原因尚不明確，ICCs以網(wǎng)絡(luò)狀分布在胃腸道，分為黏膜下ICC、肌間ICC、肌內(nèi)ICC、深層肌叢ICC這四種，結(jié)腸肌間神經(jīng)叢周圍的ICCs數(shù)目高于環(huán)、叢肌層。ICCs是胃腸道慢波的發(fā)起者，它可以產(chǎn)生慢波并通過網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及平滑肌之間的連接將慢波傳出，從而引起胃腸道的平滑肌的收縮，ICCs細(xì)胞膜上存在多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，可作為神經(jīng)沖動傳出與平滑肌之間的中介。結(jié)腸的ICCs具有控制結(jié)腸運動自主節(jié)律性的功能，ICC減少，特別是CC－SM和SS－SM的明顯減少，影響腸慢波的產(chǎn)生和傳播，擾亂腸道神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌間的信息傳遞，導(dǎo)致結(jié)腸運動功能紊亂，通過時間延長，出現(xiàn)臨床癥狀［15］。

我們實驗組嘗試從腸神經(jīng)系統(tǒng)的變化中尋找原因。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是腸神經(jīng)系統(tǒng)特殊類型的間質(zhì)細(xì)胞，大量研究表明，它是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞（Pacemaker cells）并參與慢波的傳播，對腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)信息傳遞具有重要的調(diào)控作用［16］。近年來，ICCs與胃腸動力紊亂所導(dǎo)致的疾病之間的關(guān)系也越來越得到了實驗支持，目前關(guān)于功能性便秘，國內(nèi)外已有不少相關(guān)研究，多數(shù)應(yīng)用Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD117來進行研究。例如包云光等發(fā)現(xiàn)，在慢性傳輸性便秘患者中，遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜的CD117的數(shù)量少于對照組［17］。Torihashi等對30余例慢性特發(fā)性假性腸梗阻患者的腸壁組織進行的研究指出：其中有三分之一的患者CD117陽性的ICC缺失或大量減少，從而推測ICCs的正確移行和分化障礙可能導(dǎo)致慢性特發(fā)性假性腸梗阻［18］。

在我們的研究中，通化利用免疫組合標(biāo)記Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物CD117后，分析結(jié)果顯示，在OOC患者的結(jié)腸黏膜下層中CDⅡ7陽性的細(xì)胞表達計數(shù)平均值為（28.78±0.62），肌層中CD117表達陽性細(xì)胞的計數(shù)平均值為（10.44±0.66），而在相應(yīng)對照組，結(jié)腸黏膜下層中CDII7陽性的細(xì)胞表達計數(shù)平均值為（40.96±0.63），肌層中 CD117表達陽性細(xì)胞的計數(shù)平均值為（15.24±0.68），相應(yīng)的IOD平均值也都有類似的改變。總的來說，OOC組的ICCs細(xì)胞是明顯低于對照組的，并且可見直腸黏膜下層及肌層中腸壁中的ICCs體積變小，形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變少。而王亮等發(fā)現(xiàn)在先天性巨結(jié)腸患兒狹窄段腸壁各層ICCs密度明顯減少或消失，正常網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞［19］。童衛(wèi)東等發(fā)現(xiàn)慢性傳輸性便秘患者肌壁個區(qū)域CD117的表達均下降［20］。ICCs在胃腸道不同層面幾乎都有分布，且功能也略有不同，比如肌間神經(jīng)層ICCs是胃腸道的主要起博細(xì)胞，而黏膜下層的ICCs是結(jié)腸的主要起博細(xì)胞［21］。在我們的實驗中也發(fā)現(xiàn)，無論是OOC組還是對照阻，患者的黏膜固有層中，ICCs的數(shù)量幾乎沒有變化甚至略有升高，這可能與ICCs在腸壁中不同部位的分布不同有關(guān)。結(jié)合各項實驗結(jié)果可以看出，ICCs數(shù)量的減少及功能缺失與多種胃腸道功能障礙性疾病高度相關(guān)。

正常情況下直腸膨脹刺激腸壁和恥骨直腸肌壓力感受器，引起內(nèi)、外括約肌及恥骨直腸肌松弛，肛直角變大，開始排便活動［22］。出口梗阻性便秘的發(fā)病機制目前尚不明確，但國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中的胃腸動力學(xué)、腸神經(jīng)遞質(zhì)、腸神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞等方面。恥骨直腸肌長期反復(fù)發(fā)炎、充血、水腫，引起結(jié)締組織增生纖維化，瘢痕化，最終導(dǎo)致恥骨直腸肌彈性減退，舒縮功能降低，造成排便困難，可導(dǎo)致出口梗阻性便秘［22］。我們的研究表明OOC的形成可能主要與黏膜下層及肌層中的與ICCs的功能及形態(tài)變化密切相關(guān)，ICCs的數(shù)量減少，功能減弱，可能是引起OOC發(fā)病的病理生理機制之一，而引起這以上變化的原因還有待于進一步的研究。