肖乾煌，徐雨茜，熊 華，胡蔣寧，朱雪梅，張鈺巖

(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，南昌 330047)

1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油酯(OPO)是一種具有結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)成分的sn-USU型油脂，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品中。通常采用酶促合成的方法，通過采用專一性脂酶催化制備OPO結(jié)構(gòu)脂，其相較于化學(xué)合成法，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物易回收等優(yōu)點(diǎn)。

過去，人們?cè)诶脤Ｒ恍灾负铣山Y(jié)構(gòu)脂時(shí)發(fā)現(xiàn)，其催化特性并不具有絕對(duì)專一性[1]，如通過sn-1,3專一性脂酶催化酸解法和轉(zhuǎn)酯換法制備MLM型結(jié)構(gòu)脂中發(fā)現(xiàn)有MML異構(gòu)體，在利用sn-1,3專一性脂酶催化制備sn-1,3-DAG時(shí)檢測(cè)到sn-1,2-DAG和TAG[2]，在利用sn-1,3專一性脂酶催化天然植物油脂制備低反式脂肪酸的固態(tài)脂肪時(shí)發(fā)現(xiàn)sn-2位不飽和脂肪酸減少的現(xiàn)象[3]。這些研究結(jié)果均表明，專一性脂酶法制備結(jié)構(gòu)脂中存在TAG中sn-2位脂肪酸遷移至sn-1,3位或反之的現(xiàn)象，這就是?；w移現(xiàn)象。發(fā)生?；w移會(huì)影響結(jié)構(gòu)脂的得率。影響?；w移的因素眾多，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)延長反應(yīng)時(shí)間、升高反應(yīng)溫度、過低的水分活度(aw)都會(huì)促進(jìn)酰基遷移的發(fā)生。但是關(guān)于反應(yīng)介質(zhì)對(duì)?；w移的研究還較少，特別是在特定反應(yīng)介質(zhì)下不同aw對(duì)?；w移的影響尚未見報(bào)道。

本文以三棕櫚酸甘油酯(PPP)和油茶籽油游離脂肪酸(FFA)為底物制備OPO結(jié)構(gòu)脂為反應(yīng)模型，專一性脂肪酶Lipozyme RM IM為催化劑(合成原理及可能的?；w移路徑如圖1所示)，研究不同溶劑、不同aw、不同反應(yīng)時(shí)間條件下發(fā)生的?；w移情況，以期對(duì)?；w移的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制有一定指導(dǎo)意義。

圖1 OPO結(jié)構(gòu)脂合成過程及?；w移路徑圖

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

油茶籽油，購于當(dāng)?shù)爻?油酸含量80%)；PPP(CAS為555-44-2，純度85%)，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，諾維信(中國天津)生物技術(shù)公司；胰脂肪酶(CAS為9001-62-1)，美國Sigma-Aldrich公司；脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(#463)，美國Nu-Chekprep公司；正己烷、三氯甲烷、異丙醇，色譜純，美國天地試劑有限公司(上海)；膽鹽、甲醇鈉、乙酸甲酯，分析純，阿拉丁試劑；95%乙醇、鹽酸、氫氧化鉀、硝酸鎂、氯化鋰、硫酸鉀、乙酸、無水硫酸鈉、無水乙醚、石油醚、正己烷、丙酮、叔丁醇等均為分析純。

Agilent Technologies 7890B 氣相色譜儀、火焰檢測(cè)器，美國安捷倫公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA集團(tuán)；BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)公司；ZH-S全溫振蕩器；磁力攪拌水浴鍋；LXJ-IIB 型臺(tái)式離心機(jī)；UGC-12M型氮吹儀；硅膠板；薄層層析展開缸；碘蒸氣層析缸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶籽油FFA的提取

參照Wanasundara等[4]的方法并稍作改動(dòng)。稱取25 g油茶籽油置于平底燒瓶中，依次加入5.75 g KOH、77 mL去離子水-95%乙醇溶液(體積比1∶6)，四者混合物置于80℃、200 r/min條件下油浴冷凝回流皂化1 h。皂化結(jié)束后，加入150 mL去離子水-正己烷溶液(體積比1∶2)，充分振蕩后萃取冷卻反應(yīng)物兩次，收集含皂化物的無機(jī)相后用3 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至1～2釋放FFA。然后加入55 mL正己烷萃取FFA，收集有機(jī)相并用無水Na2SO4柱脫水， 40℃旋蒸去除有機(jī)溶劑，即得油茶籽油FFA，充N2后于-20℃儲(chǔ)存。

1.2.2aw的預(yù)平衡

根據(jù)Sabbani等[5]采用飽和鹽溶液預(yù)平衡各反應(yīng)物aw法，對(duì)合成OPO結(jié)構(gòu)脂的原材料進(jìn)行aw的調(diào)控。將油茶籽油FFA和PPP、有機(jī)溶劑(正己烷、丙酮、叔丁醇)以及固定化脂肪酶Lipozyme RM IM分別放置于裝有飽和鹽溶液的密封干燥器中預(yù)平衡48 h以上。飽和鹽溶液的水分活度分別為：LiCl，aw=0.11；Mg(NO3)2，aw=0.53；K2SO4，aw=0.97。

1.2.3 OPO結(jié)構(gòu)脂的合成[6]

稱取摩爾比為1∶5的底物PPP和油茶籽油FFA于具塞三角瓶中，加入3倍底物總質(zhì)量的溶劑，反應(yīng)物置于全溫振蕩器中50℃、200 r/min充分振蕩混合20 min。待底物充分溶解后，加入底物總質(zhì)量10%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM于體系中分別反應(yīng)0、2、4、6、8 h，反應(yīng)結(jié)束離心除酶后，將產(chǎn)物OPO結(jié)構(gòu)脂置于-20℃儲(chǔ)存。

1.2.4 脂肪酸組成分析

根據(jù)Zou等[7]方法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物 OPO結(jié)構(gòu)脂進(jìn)行總脂肪酸分析。準(zhǔn)確稱量2 mg反應(yīng)產(chǎn)物于玻璃試管中，依次加入正己烷1.5 mL、乙酸甲酯40 μL、0.5 mol/L甲醇鈉100 μL，充分渦旋混勻溶解，室溫條件下水浴甲基化反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)入-20℃冷凍處理10 min，冷凍結(jié)束后立即加入飽和草酸溶液60 μL，與過量Na+反應(yīng)，4 500 r/min離心5 min去除草酸鈉等沉淀。取離心管內(nèi)上層有機(jī)相溶液過無水Na2SO4柱，N2吹干。樣品經(jīng)正己烷稀釋后，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，吸取1 mL樣品進(jìn)行GC分析。

GC分析條件參考文獻(xiàn)[8]。樣品GC數(shù)據(jù)分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，峰面積歸一化法定量分析。

1.2.5 sn-2位脂肪酸組成分析

根據(jù)Pacheco等[9]的方法對(duì)樣品進(jìn)行脫酸處理。由于合成OPO結(jié)構(gòu)脂底物原料PPP熔點(diǎn)較高(>60℃),所以在脫酸處理過程中需加入適量正己烷使其充分溶解，從而有利于發(fā)揮胰脂肪酶對(duì)底物的水解作用。

準(zhǔn)確稱取0.01 g反應(yīng)產(chǎn)物置于帶蓋玻璃管中，加入20 μL正己烷溶解，隨后依次加入0.05%膽鹽溶液2.5 mL、2.2% CaCl2溶液1 mL、1 mol/L Tris-HCl緩沖液10 mL，渦旋后加入0.01 g胰脂肪酶，再次渦旋1 min。室溫條件下水浴反應(yīng)10 min，取出振蕩，重復(fù)一次。待反應(yīng)物水解完全，加5 mL正己烷充分搖勻萃取。最后取上層萃取液過無水Na2SO4柱，N2濃縮，樣品于-20℃儲(chǔ)存待用。

取少量三氯甲烷于上述氮吹樣品中復(fù)溶，進(jìn)行薄層色譜分離。待點(diǎn)板在室溫下風(fēng)干后，在展開劑為乙醚-正己烷-乙酸(體積比50∶50∶1)下展開，隨后使用碘蒸氣染色，刮取MAG硅膠帶，置于玻璃試管中，加3 mL正己烷振蕩溶解，然后加1 mL 2 mol/L甲醇鈉-KOH溶液甲酯化，渦旋混勻，2 500 r/min離心20 min，取上清液過無水Na2SO4柱、0.22 μm有機(jī)相濾膜，進(jìn)行GC分析。

sn-1,3位脂肪酸含量計(jì)算公式為：sn-1,3位脂肪酸含量=(3×總脂肪酸含量-sn-2位脂肪酸含量)/2。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每個(gè)樣品均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對(duì)OPO結(jié)構(gòu)脂合成中?；w移的影響

在酶促酸解合成OPO結(jié)構(gòu)脂反應(yīng)期間，通過使用不同因素影響sn-1,3位特異性脂肪酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象和催化活性，從而合成理想產(chǎn)物。李人望[10]研究發(fā)現(xiàn)，在相同的aw下，有機(jī)溶劑可通過立體障礙和傳質(zhì)阻力阻礙脂肪酶接近底物，從而降低其催化活性。同時(shí)，由于親、疏水性溶劑對(duì)脂肪酶必需水化層剝奪能力的不同(親水性>疏水性)，所以有機(jī)溶劑剝離脂肪酶必需水化層的能力不可忽略。aw為0.53時(shí)，不同溶劑對(duì)固定化脂肪酶Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂脂肪酸組成的影響如圖2所示。

圖2 溶劑對(duì)Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂脂肪酸組成的影響

由圖2可知，在aw為0.53時(shí)，棕櫚酸(P)在終產(chǎn)物sn-2位的含量為丙酮>叔丁醇>正己烷，油酸(O)在終產(chǎn)物sn-1,3位的含量與P有相同順序。在叔丁醇與丙酮反應(yīng)體系中，sn-1,3位O含量分布大體一致。各溶劑的結(jié)構(gòu)和極性差異是造成3種溶劑對(duì)sn-1,3位O和sn-2位P含量高低分布影響的主要因素。此外，酶促酸解反應(yīng)在3種反應(yīng)介質(zhì)體系的反應(yīng)過程中，sn-2位P含量均隨反應(yīng)時(shí)間的延長而降低，其中正己烷反應(yīng)介質(zhì)體系的sn-2位P含量的相關(guān)曲線在2～8 h階段呈現(xiàn)先趨于穩(wěn)定不變而后急劇下降的趨勢(shì)，而丙酮反應(yīng)介質(zhì)體系的相關(guān)曲線在整個(gè)反應(yīng)過程中sn-2位P含量變化較其余兩組平緩。3種反應(yīng)介質(zhì)體系中sn-1,3位O含量均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而不斷增加。在酶促酸解反應(yīng)初期， sn-1,3位O含量迅速上升，之后在2～8 h之間，其含量呈緩慢上升趨勢(shì)。對(duì)終產(chǎn)物sn-2位P含量變化的考察結(jié)果說明底物在酶促酸解反應(yīng)過程中確實(shí)發(fā)生了酰基遷移，與合成OPO結(jié)構(gòu)脂?；w移原理理論上一致(見圖1)。

研究表明，?；w移是自發(fā)產(chǎn)生的，且在酶促酸解反應(yīng)體系中無法制止[11]。對(duì)酶促酸解反應(yīng)影響最小即遷移率最低的為非質(zhì)子極性溶劑(丙酮)[12-13]。在酶促酸解反應(yīng)過程中，自發(fā)性?；w移與溶劑物化性質(zhì)以及酶的立體特異性有不同程度的線性關(guān)系。其中脂肪酶立體特異性與溶劑的極性密切相關(guān)，在反應(yīng)過程中，固定化脂肪酶Lipozyme RM IM專一性水解PPP的sn-1位和sn-3位，其專一性的穩(wěn)定與結(jié)構(gòu)特性和本身的催化活性呈正相關(guān)。不同極性溶劑通過改變酶促酸解反應(yīng)過渡態(tài)中間體-5原子酯環(huán)的電荷分散情況來影響反應(yīng)體系所需的活化能，所以酶促酸解反應(yīng)過程中電荷越分散，過渡態(tài)所需活化能越低，越利于?；w移的發(fā)生[14-16]。研究顯示，固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在丙酮體系中對(duì)sn-1,3位專一性最好，而在正己烷體系中最弱，與3種溶劑的極性大小呈負(fù)相關(guān)[17]。

2.2 aw對(duì)OPO結(jié)構(gòu)脂合成中?；w移的影響

在絕對(duì)無水的情況下，固定化脂肪酶Lipozyme RM IM理論上不具有催化活性。水分子在穩(wěn)定脂肪酶活性中具有重要作用，因?yàn)樗芡ㄟ^多種作用力(疏水鍵、氫鍵、范德華力、靜電吸附等)直接或間接對(duì)其產(chǎn)生影響，尤其在非水相-有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)過程中，與溶劑的親、疏水性密切相關(guān)。根據(jù)報(bào)道，有機(jī)介質(zhì)中水分子的有效性無法通過其濃度進(jìn)行量化，因?yàn)槿軇┑臉O性強(qiáng)烈影響著水與有機(jī)溶劑相互結(jié)合的能力[18]。圖3、圖4和圖5分別展現(xiàn)了在正己烷、叔丁醇、丙酮反應(yīng)介質(zhì)體系中不同aw(0.11、0.53、0.97)下，對(duì)固定化脂肪酶Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂脂肪酸組成的影響。

圖3 aw對(duì)正己烷體系Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂脂肪酸組成的影響

由圖3～圖5可知，sn-2位P含量均隨反應(yīng)時(shí)間延長存在不同程度的下降，表明PPP在酶促酸解反應(yīng)過程中確實(shí)發(fā)生了?；w移。而sn-1,3位O含量上升趨勢(shì)不同，說明不同aw對(duì)固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在酶促酸解反應(yīng)過程中的催化活性和TAG sn-1,3位選擇性的影響有顯著差異。

圖4 aw對(duì)叔丁醇體系Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂脂肪酸組成的影響

圖5 aw對(duì)丙酮體系Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂脂肪酸組成的影響

在正己烷體系中、當(dāng)酶促酸解反應(yīng)4 h時(shí)，aw為0.53的sn-2位P含量開始較相同情況下aw為0.11、0.97的高。sn-1,3位O含量在反應(yīng)2 h內(nèi)，3組aw對(duì)應(yīng)的脂肪酸含量趨于吻合，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，3組aw下的O含量逐漸上升，其中aw為0.11上升趨勢(shì)最為緩慢，aw為0.53最快。不過aw為0.97與aw為0.53的O含量曲線上升幅度相當(dāng)。總體而言，3組aw的大小與相應(yīng)位置脂肪酸的含量成線性關(guān)系，即sn-1,3位O和sn-2位P含量大?。篴w為0.53>aw為0.97>aw為0.11。其原因是固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在不同aw下，內(nèi)部柔韌性和氨基酸運(yùn)動(dòng)造成的[19-20]。隨著體系aw上升，脂肪酶柔性增強(qiáng)，從而在脂肪酶的活性位點(diǎn)周圍有更多的水分子與其結(jié)合，使脂肪酶活性增加，進(jìn)攻1,3位置的能力增強(qiáng)。隨著aw的進(jìn)一步提高，可能由于脂肪酶水合作用達(dá)到臨界值，體系中存在大量水分子從而導(dǎo)致競爭性水解反應(yīng)增強(qiáng)。此外，也有可能是因?yàn)檫^量的水分子阻塞脂肪酶部分活性位點(diǎn)，抑制底物與脂肪酶的接觸造成的[21-24]。綜合分析，aw為0.53的正己烷體系，在酶促酸解反應(yīng)6 h下能夠得到較理想的終產(chǎn)物。

在叔丁醇體系中，3組aw對(duì)終產(chǎn)物sn-2位P及sn-1,3位O含量的影響無顯著性差異。aw為0.11時(shí)，sn-2位P含量隨反應(yīng)的進(jìn)行而緩慢降低，較其余兩組下降速度更快，aw為0.53和aw為0.97的含量曲線幾乎重合。酶促酸解反應(yīng)2 h內(nèi)，3組aw的sn-1,3位O含量曲線基本重合，與正己烷體系中一致。反應(yīng)2～8 h sn-1,3位O含量緩慢上升，其中aw為0.53時(shí)O含量上升最快。這可能與固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在叔丁醇體系中的活性有關(guān)。

在丙酮體系中，3組aw的sn-2位P和sn-1,3 位O含量曲線差異明顯，含量高低順序：aw為0.97>aw為0.53>aw為0.11，表明aw越高，越不利于酶促酸解反應(yīng)過程中酰基遷移的發(fā)生。aw為0.11時(shí)sn-2位P含量最低，與aw為0.53和aw為0.97的P含量相差較大，aw為0.53和aw為0.97的P含量相差較小，這可能是由于在低aw環(huán)境下，中間體電荷更為容易分散，反應(yīng)所需活化能較低，從而導(dǎo)致?；w移率更高。3組aw在反應(yīng)2 h內(nèi)，sn-1,3位O含量均迅速上升，而后緩慢增加。反應(yīng)6 h后，O含量變化平緩，可能由于此時(shí)反應(yīng)體系已趨于平衡。與正己烷、叔丁醇體系相比，其sn-2位P和sn-1,3位O含量更高，3組溶劑體系sn-2位P、sn-1,3位O含量范圍分別為：62.69%～80.63%、47.18%～59.21%(正己烷體系)；81.53%～86.52%、56.66%～64.06%(叔丁醇體系)；89.35%～94.51%、59.60%～69.01%(丙酮體系)。

3 結(jié) 論

采用酶促酸解法，以油茶籽油FFA為酰基供體、PPP為酰基受體，對(duì)比不同溶劑和aw在OPO結(jié)構(gòu)脂合成中?；w移的影響。結(jié)果表明，當(dāng)aw為0.53時(shí)，不同溶劑下對(duì)固定化脂肪酶Lipozyme RM IM合成OPO結(jié)構(gòu)脂?；w移的影響結(jié)果為：棕櫚酸在終產(chǎn)物sn-2位的含量高低順序?yàn)楸?叔丁醇>正己烷；油酸在終產(chǎn)物sn-1,3位的含量高低順序?yàn)楸?叔丁醇>正己烷。在3種溶劑中，丙酮的反應(yīng)環(huán)境下?；w移發(fā)生率最低且油酸的鍵入率最高。相同溶劑、不同aw對(duì)?；w移的影響結(jié)果表明：sn-2位的棕櫚酸含量均隨反應(yīng)時(shí)間的延長而降低；在3組不同aw條件下，其sn-2位的棕櫚酸和sn-1,3位油酸的含量均在aw為0.53時(shí)較高，說明即使在不同溶劑環(huán)境下，脂肪酶的1,3位置選擇性強(qiáng)弱依然決定于aw的高低。鑒于結(jié)構(gòu)脂制備過程中的綠色環(huán)保安全角度，可以采用無溶劑體系但是應(yīng)較好地控制反應(yīng)體系的aw以抑制酰基遷移。