浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝組織對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是一系列復(fù)雜因素（如生長因子和氧化應(yīng)激）共同作用的結(jié)果[1-2]。有研究報道肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，該過程受氧化應(yīng)激、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）等諸多因素的影響，而誘導(dǎo)HSC凋亡或抑制其活化增殖被認(rèn)為能夠有效降低甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化[3-4]。前期研究顯示，AngⅡ能早期刺激 HSC產(chǎn)生活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS），激活諸多因子參與的信號網(wǎng)絡(luò)，刺激HSC增殖，誘導(dǎo)肝纖維化形成，提示AngⅡ誘導(dǎo)ROS的生成是肝纖維化發(fā)生的潛在機(jī)制[5-6]。

合歡皮-白蒺藜是浙江省名中醫(yī)姚真敏教授在臨床治療慢性肝病時常用的藥對，緩解肝脾腫大療效顯著。合歡皮性平味甘,歸心、肝經(jīng)，有安神解郁、活血消腫之功效[7-8]。白蒺藜性平，味苦、辛，入肝經(jīng)，有平肝解郁、祛風(fēng)明目之功效。已有報道證實白蒺藜具有抑癌和抗纖維化作用，也可增強(qiáng)抗氧自由基酶類的活性，拮抗脂質(zhì)過氧化[9-10]。目前關(guān)于合歡皮-白蒺藜對肝纖維化影響的研究較少，故本研究采用血清藥理學(xué)、MTT、Western blot及 Real-time PCR 等研究方法，觀察合歡皮-白蒺藜藥對含藥血清對AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境下HSC的增殖情況以及對相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，以初步探討合歡皮-白蒺藜藥對含藥血清的細(xì)胞干預(yù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細(xì)胞 SPF級雄性SD大鼠 60只，體質(zhì)量180～200g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （滬）2013-2016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]，每籠5只，以普通飼料喂養(yǎng)，溫度25℃、每日光照黑暗時間各半。人源性HSC-LX2細(xì)胞購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 主要藥品和試劑 合歡皮購于杭州華東中藥飲片有限公司（批號：180407）；白蒺藜購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司（批號：171101）；維生素E軟膠囊購于浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠 （批號：180531），使用時以蓖麻油溶解；馬來酸依那普利片購于江蘇制藥股份有限公司揚子江藥業(yè)集團(tuán) （批號：15092411），使用時以蒸餾水溶解。胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司 （批號：11012-8611）；RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素和鏈霉素）均購于美國 Gibco 公司（批號：8118320、15140-122）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于 Vetec 公司（批號：V900090）；AngⅡ購于美國 Sigma 公司（批號：A9525）；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：P0012）；蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）兔單克隆抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔單克隆抗體、血紅素氧化酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）兔單克隆抗體和核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）兔單克隆抗體均購于abcam公司（批號：ab179522、ab5694、ab68477、ab62352）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體和β-actin兔單克隆抗體均購于 Cell Signaling公司 （批號：D16H11、#4970）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG購于達(dá)文生物有限公司（批號：DW-GAR007）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒均購于Takara公司（批號：AHF1813A、AI40832A、AI40775A）。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 AE200倒置生物顯微鏡購于Motic公司；L500離心機(jī)購于長沙湘儀有限公司；Clinx化學(xué)成像分析儀購于上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品；imark酶標(biāo)儀和實時定量PCR儀均購于Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清的制備 根據(jù)臨床的配伍經(jīng)驗，合歡皮-白蒺藜藥對以5:4比例配比，分為高、中、低劑量組，另外設(shè)有空白組、維生素E組及依那普利組。合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組的劑量為60kg體質(zhì)量成人每日總服藥用量的2、1、0.5倍，換算成動物給藥劑量分別為 10.8g/（kg·d）、5.4g/（kg·d）、2.7g/（kg·d），按10mL/kg的劑量灌胃給藥；維生素E組以30mg/（kg·d）的維生素E溶液灌胃；依那普利組以10mg/（kg·d）的依那普利溶液灌胃；空白組以0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組大鼠灌胃2次/d，時間間隔6h，連續(xù)給藥7d。末次給藥2h后，大鼠腹腔注射3%異戊巴比妥麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置1h后，4℃下3 000r/min離心20min，吸取上層血清至離心管，56℃滅活30min，微孔濾膜過濾后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞采用含1%雙抗和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d換液，待密度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞，胰酶消化制備單細(xì)胞懸液后，以5×103個/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板，每孔100μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。陰性對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何處理。除陰性對照組外，其余各組均加入 10-5mol·L-1的 AngⅡ 100μL 處理 24h，再正常培養(yǎng)。除AngⅡ組加入胎牛血清外，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組、維生素E組、依那普利組以及空白血清組分別加入同樣體積的相應(yīng)大鼠血清：合歡皮-白蒺藜高、中、低劑量組大鼠血清、維生素E組大鼠血清、依那普利組大鼠血清以及空白組大鼠血清。各組加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，每孔加入5mg·mL-1的 MTT 20μL，37℃孵育 4h 后，棄去上清液，加入DMSO 150μL，充分振蕩10min，待藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶充分溶解，于570nm波長下檢測各孔吸光值，各組吸光度與AngⅡ組吸光度的比值代表細(xì)胞增殖率。

1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞分組同1.2.3，待細(xì)胞貼壁，除陰性對照組外，其余各組細(xì)胞均以10-5mol·L-1的AngⅡ刺激 24h，再加入含藥血清或胎牛血清配成的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入一抗（GAPDH稀釋比例1:5 000、β-actin稀釋比例1:5 000、PKC稀釋比例1:2 000、α-SMA稀釋比例 1:1 000、HO-1稀釋比例 1:1 000、Nrf2稀釋比例1:1 000）4℃孵育過夜，用TBST洗膜3次后加入二抗（羊抗兔IgG稀釋比例1:2 000）室溫振搖孵育2h。吸去二抗洗凈后，以化學(xué)成像分析儀掃膜，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值來表示蛋白相對表達(dá)量。α-SMA蛋白以GAPDH為內(nèi)參，其余目標(biāo)蛋白均以β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 Real-time PCR檢測相關(guān)mRNA的表達(dá) 細(xì)胞分組同1.2.3，除陰性對照組外，其余各組均以10-5mol·L-1的AngⅡ刺激24h，再加入含藥血清或胎牛血清配成的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。Trizol法提取總RNA，Nanodrop核酸蛋白測定儀檢測RNA樣本濃度與純度，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR法進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5μL，10μmol·L-1的 Primer（mix）2μL，cDNA 2μL，滅菌水 8.5μL。 每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，在實時定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s， 共 40 個循環(huán)。以 β-actin 為內(nèi)參基因，與 AngⅡ組比較，采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graghpad 7.0和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；進(jìn)一步兩組間比較采用Student-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率比較 不同處理時長條件下空白血清組與AngⅡ組細(xì)胞增殖率無統(tǒng)計學(xué)差異 （P>0.05）。處理24h后，與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組均能顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖（P<0.01，P<0.001，P<0.001），依那普利組細(xì)胞增殖也受到抑制（P<0.001），維生素E組細(xì)胞增殖則明顯增強(qiáng)（P<0.05）。處理48h后，與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組均能顯著抑制HSCLX2 細(xì)胞增殖（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），依那普利組細(xì)胞增殖也受到抑制（P＜0.001），維生素E組細(xì)胞增殖則明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。處理72h后，與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組均能顯著抑 制 HSC-LX2 細(xì) 胞 增 殖 （P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001），依那普利組細(xì)胞增殖也受到抑制（P＜0.001），維生素E組細(xì)胞增殖則明顯增強(qiáng)（P＜0.001）。見圖1。2.2 各組細(xì)胞α-SMA表達(dá)比較 與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組α-SMA蛋白表達(dá)減低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），依那普利組和維生素 E 組表達(dá)也降低（P＜0.001，P＜0.001）。 與 AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組α-SMA 的 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），依那普利組和維生素E組表達(dá)也降低 （P＜0.001，P＜0.001）。 見圖 2。

圖1 各組細(xì)胞增殖率比較Fig.1 Comparison of cell proliferation rate in each group

2.3 各組細(xì)胞PKC、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)比較 與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對低劑量組PKC蛋白表達(dá)降低（P<0.05），高、中劑量組PKC蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；依那普利組和維生素E組表達(dá)也降低（P<0.01，P<0.001）。 與 AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中劑量組Nrf2蛋白表達(dá)降低（P<0.001，P<0.01），低劑量組蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05）；依那普利組蛋白表達(dá)也降低 （P<0.01），維生素E組蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05）。與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中劑量組 HO-1 蛋白表達(dá)降低（P<0.001，P<0.001），低劑量組蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；依那普利組表達(dá)降低（P<0.01），維生素E組表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。由此得出，與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組具有一定的抗氧化效果，維生素E組則呈現(xiàn)較好的抗氧化活性，依那普利含藥血清也具有抗氧化活性。

2.4 各組細(xì)胞PKC、Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)比較與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組 PKC mRNA 表 達(dá) 減 少 （P<0.001，P<0.001，P<0.001），依那普利組和維生素E組表達(dá)也降低 （P<0.001，P<0.001）。 與 AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組Nrf2 mRNA表達(dá)降低（P<0.001，P<0.001，P<0.05），依那普利組表達(dá)降低（P<0.001），維生素E組表達(dá)升高（P<0.05）。與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中劑量組HO-1 mRNA表達(dá)降低（P<0.001，P<0.001），低劑量組 HO-1 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），依那普利組表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），維生素E組表達(dá)升高（P<0.05）。 見圖 4。

3 討論

圖2 各組細(xì)胞α-SMA表達(dá)比較Fig.2 Comparison of expression of α-SMA in each group

圖3 各組細(xì)胞PKC、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of protein expression of PKC,Nrf2 and HO-1 in each group

圖4 各組細(xì)胞PKC、Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)比較Fig.4 Comparison of mRNA expression of PKC,Nrf2 and HO-1 in each group

眾所周知，肝纖維化是一系列復(fù)雜因素（如生長因子和氧化應(yīng)激）共同作用的結(jié)果。HSC活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，HSC的活化和增殖導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常沉積[1-2]。 研究證實，HSC的活化與氧化應(yīng)激、AngⅡ等諸多因素相關(guān)，誘導(dǎo)HSC凋亡或抑制其活化增殖能夠有效降低肝纖維化程度，甚至能逆轉(zhuǎn)肝纖維化[3-4]。

研究指出，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）在肝纖維化的發(fā)病過程中具有重要地位，肝組織也存在RAAS，而且與肝纖維化機(jī)制相關(guān)[11-12]。在諸多肝損傷因素誘導(dǎo)肝纖維化的過程中均可觀察到不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)ROS過度產(chǎn)生，這一病理過程同時伴有抗氧化防御功能的減弱，氧化應(yīng)激與抗氧化反應(yīng)兩者的平衡關(guān)系遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞甚至組織損傷。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致諸多肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素[13-14]。HSC受到氧化因子刺激后，細(xì)胞膜上的PKC被激活，從而以磷酸化方式激活Nrf2[5,15]。Nrf2-抗氧化反應(yīng)原件 （antioxidant response element，ARE）信號通路是被廣泛報道的抗氧化應(yīng)激信號通路，該通路對于肝臟疾病的防治具有重要意義[16-18]。PKC激活Nrf2-ARE通路并能夠調(diào)控該通路上其他相關(guān)基因的表達(dá)。被激活的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核后與ARE結(jié)合，進(jìn)而激活HO-1等下游抗氧化保護(hù)性基因。因此，Nrf2被認(rèn)為是治療肝臟疾病的新靶點，同時PKC-Nrf2可調(diào)控HO-1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)其抗氧化作用和組織保護(hù)作用[5,19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮-白蒺藜含藥血清能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而抑制HSC-LX2細(xì)胞的增殖。MTT結(jié)果顯示，與AngⅡ組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量組均能顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖，且隨著劑量減低，抑制效果有增強(qiáng)的趨勢；與依那普利組比較，低劑量組抑制增殖效果相當(dāng)；與陰性對照組比較，合歡皮-白蒺藜藥對高、中、低劑量細(xì)胞增殖情況差異較小，表明經(jīng)中藥含藥血清處理后細(xì)胞增殖活性能夠恢復(fù)到AngⅡ刺激前的狀態(tài)。α-SMA作為HSC活化的特有標(biāo)志蛋白，其表達(dá)強(qiáng)度與HSC增殖以及肝纖維化程度呈正相關(guān)，即肝纖維化程度越嚴(yán)重，α-SMA表達(dá)越高[20-21]。AngⅡ刺激后，α-SMA表達(dá)上調(diào)，合歡皮-白蒺藜含藥血清干預(yù)后表達(dá)降低；同時依那普利組和維生素E組α-SMA的表達(dá)也降低。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，AngⅡ刺激后PKC的表達(dá)明顯上調(diào)，Nrf2、HO-1也隨之高表達(dá)，這提示AngⅡ激活了PKC，并通過誘導(dǎo)Nrf2、HO-1激發(fā)了機(jī)體潛在的抗氧化活性，但其中具體機(jī)制尚未明確。與AngⅡ組比較，經(jīng)合歡皮-白蒺藜含藥血清干預(yù)后，PKC的表達(dá)受到了抑制，其中合歡皮-白蒺藜低劑量組的抑制作用最明顯，與α-SMA的結(jié)果類似；HO-1和Nrf2的表達(dá)也受到了不同程度的抑制，但低劑量組的抑制作用最弱。合歡皮-白蒺藜低劑量組對以上蛋白表達(dá)的影響趨勢與維生素E較為相似，因此筆者推測合歡皮-白蒺藜的抗氧化作用機(jī)制可能類似于維生素E，但是否存在量效關(guān)系還需進(jìn)一步研究。以上結(jié)果說明合歡皮-白蒺藜藥對含藥血清可能通過抗氧化途徑抑制 HSC-LX2細(xì)胞增殖，從而阻止肝纖維化發(fā)展。

綜上所述，AngⅡ可以誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，繼而上調(diào)PKC、Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)，最終引起HSC-LX2細(xì)胞增殖。合歡皮-白蒺藜含藥血清可能通過抗氧化途徑抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖，從而阻止肝纖維化發(fā)展，其作用機(jī)制可能類似于維生素E。關(guān)于合歡皮-白蒺藜的體內(nèi)代謝問題以及含藥血清在細(xì)胞內(nèi)的具體作用途徑，后續(xù)研究中將采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)進(jìn)一步探討。