滕飛 楊波 林能明

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院浙江省臨床腫瘤藥理與毒理學(xué)研究重點實驗室 3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

唇形科香茶菜屬[Lamiaceae Isodon(Schrader ex Bentham)Spac]植物是我國民間的常用草藥，供藥用的有30多種，富含萜類、黃酮、揮發(fā)油等多種成分。孫漢董院士等從香茶菜屬植物中分離出80多種化學(xué)物質(zhì)[1]，其中二萜類是香茶菜屬植物中最典型的化合物類型[1-3]。浙江香茶菜屬植物分布廣泛，種類豐富，且不同生長環(huán)境和不同種類的香茶菜屬植物地下部位二萜類含量明顯不同，其藥理作用也大不相同[4-6]。據(jù)《浙江省中藥炮制規(guī)范（2015版）》[7]收載，中藥香茶菜（Rhizoma Isodone）又名鐵菱角、菱角三七，其來源是植物香茶菜或大萼香茶菜及同屬數(shù)種植物的干燥根莖或地上部分。

邁克爾受體分子（Michael acceptor molecular）是含有烯鍵或炔鍵與吸電子基形成的親電共軛體系的一類化合物，其與親核負電體系進行的共軛加成反應(yīng)稱為邁克爾加成反應(yīng) （Michael addition reaction）[8-9]。已有研究報道，香茶菜屬植物中存在大量對映貝殼杉烷型二萜類邁克爾受體分子，如冬凌草甲素、冬凌草乙素等[10-11]，該類化合物具有廣譜抗腫瘤活性，且其活性機制與D環(huán)中的exo-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)有關(guān)，該結(jié)構(gòu)可與氨基酸中的氨基、羥基、巰基等親核基團發(fā)生反應(yīng)，從而顯示出較好的抗腫瘤活性[12-13]；故其也可與細胞中的還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）發(fā)生反應(yīng)，降低細胞GSH水平，引起細胞受損及死亡[14]。

為研究浙江省香茶菜屬不同植物的抗腫瘤活性和其中可能含有的有效成分，筆者選取產(chǎn)自浙江的7種香茶菜屬植物，對其不同生長部位的有效成分含量差異進行了研究，并對對映貝殼杉烷型二萜類邁克爾受體分子抗腫瘤有效成分進行快速發(fā)現(xiàn)，以期初步闡明其抗腫瘤藥效物質(zhì)，并為研究邁克爾受體分子活性成分的發(fā)現(xiàn)提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試藥 香茶菜[Isodon amethystoides(Bentham)H.Hara]、顯脈香茶菜 [Iondon nervosus(Hemsley)Kud?]、碎米椏[Isodon rubescens(Hemsley)H.Hara]采自浙江杭州市臨安區(qū)；長管香茶菜 [Isodon longitubus(Miquel)Kud?]、大萼香茶菜[Isodon macrocalyx(Miquel)Kud?]采自浙江麗水龍泉市住龍鎮(zhèn)；線紋香茶菜[Isodon lophanthoides(Buch.Ham ex D.Don)Hara]、岐傘香茶菜 [Isodon macrophyllus (Migo)H.Hara]采自浙江衢州市開化縣，標本均保存于浙江中醫(yī)藥大學(xué)標本館。

1.2 主要儀器 超高效液相色譜儀購于美國Waters公司，色譜柱為Waters ACQuity UPLC C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）； 超低溫冰箱為美國 Forma公司產(chǎn)品；MK-3酶標儀購于美國Thermo Labsystems公司；D2012 Plus臺式高速微量小型離心機購于上海安亭科學(xué)儀器公司。

1.3 主要試劑 GF254薄層層析硅膠板購于青島海洋化工公司（批號：T11254）；甲醇、乙腈、香草醛購于上 海 阿 拉 丁 公 司 （批 號 ：M116126、A119010、B135387）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購于美國Gibco 公司（批號：12100046、25200-056）；無支原體胎牛血清購于美國 Hyclone公司 （批號：SH30084.03）；MTT試劑購于美國 Amresco公司 （批號：97062-376）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）為美國Sigma 公司產(chǎn)品（批號：D2650）。

1.4 細胞株 人源乳腺癌細胞MCF-7購于上海酶研生物科技有限公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥理研究所提供，采用含10%無支原體胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 樣品制備 取顯脈香茶菜地上部分約200g，粉碎后以95%乙醇1 600mL（約8倍量）回流提取3次，45min/次，合并3次提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，減壓蒸發(fā)回收乙醇至全干，加水混懸至約100mL，加等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，減壓蒸發(fā)回收乙酸乙酯至全干，即得到顯脈香茶菜地上部分乙酸乙酯提取物 （以下簡稱INE1）。

同樣方法制備顯脈香茶菜地下部分提取物（INE2）；長管香茶菜地上、地下部分提取物（ILO1、ILO2）；大萼香茶菜地上、地下部分提取物（IMA1、IMA2）；香茶菜地上、地下部分提取物（IAM1、IAM2）；線紋香茶菜地上部分提取物(ILS1)；碎米椏地上、地下部分提取物（IRU1、IRU2）；岐傘香茶菜地上、地下部分提取物（IMS1、IMS2）。

1.5.2 薄層色譜分析檢識探究不同樣品提取物的成分差異 為探究不同樣品之間成分的差異性，對上述13種香茶菜屬植物提取物進行薄層色譜分析（thin layer chromatography，TLC）檢識。先將 13種樣品點在同一塊GF254硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯3:2混合溶液為展開劑，展距約為9cm。待展開劑晾干后，于254nm紫外燈下檢識，1%硫酸-香草醛溶液顯色，110℃加熱至顯色清晰。

1.5.3 MTT法測定不同樣品提取物對腫瘤細胞的抑制作用 取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的人源乳腺癌細胞MCF-7，制成細胞密度為1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板。每孔加入細胞懸液100μL，再加入以DMSO溶解的不同樣品提取物溶液10μL，以培養(yǎng)液補足體積為200μL，每個樣品設(shè)置6個復(fù)孔；同時設(shè)置陰性對照組，細胞懸液體積同上，加入適量的磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS）補足體積；空白對照組為不含細胞的培養(yǎng)基和DMSO[15]。培養(yǎng)48h后，以MTT法檢測570nm波長處的光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率（%）和半數(shù)抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）。 計算公式：細胞增殖抑制率（%）=[1-（OD不同樣品組-OD空白對照組）/（OD陰性對照組-OD空白對照組）]×100%。依據(jù)細胞增殖抑制率計算IC50。

1.5.4 超高效液相色譜分析 依據(jù)MTT活性檢測結(jié)果，大萼香茶菜地上部分對MCF-7細胞活性抑制效果最好，其余樣品無明顯抑制效果，因此選用大萼香茶菜地上部分進行后續(xù)實驗，采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）對大萼香茶菜地上部分進行了分析。取IMA1 5mg加甲醇1mL配成濃度為5mg·mL-1的甲醇溶液，10 000r/min離心 15min，取上清液進行分析。進樣量：1μL；柱溫：30℃；樣品溫度：25℃；檢測波長：220nm；流速：0.25mL·min-1；流動相：水-乙腈；梯度：0～1min 25%乙腈；1～21min 25%～85%乙腈；21～23min 85%乙腈；23～24min 85%～25%乙腈；24～27min 25%乙腈。

1.5.5 GSH探針分析 將IMA1樣品配制成20mg·mL-1甲醇溶液，取40μL加入三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸[Tris(hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloride，Tris-HCl]緩沖液-GSH 360μL作為實驗組，以pH=8.00的Tris-HCl緩沖液作為陰性對照，37℃反應(yīng)2h，10 000r/min離心15min，取上清液進行UPLC分析，色譜條件同1.5.4。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各樣品TLC檢識結(jié)果 各樣品TLC檢識結(jié)果見圖 1。 圖中 1～13 分別為樣品 INE1、INE2、ILO1、ILO2、IMA1、IMA2、IAM1、IAM2、ILS1、IRU1、IRU2、IMS1、IMS2。地上部分在254nm紫外燈下進行檢識；地下部分斑點以1%硫酸-香草醛溶液為顯色劑，日光下較為清晰。 地上部分樣品 INE1（A1）、ILO1（A3）、ILS1（A9）、IMS1（A12）均有一個綠色斑點和一個黃色斑點，IMA1（A5）較其他地上部分樣品多一個淡黃色斑點，而 IAM1（A7）和 IRU1（A10）的下部出現(xiàn)一個額外的淺褐色斑點。地下部分斑點以1%硫酸-香草醛溶液為顯色劑，日光下較為清晰。其中樣品INE2（B2）無可見斑點，ILO2（B4）、IAM2（B8）、IRU2（B11）、IMS2（B13）中部有一紫色斑點，IAM2（B8）上部還有一額外斑點，而IMA2（B6）只有上部有一棕色斑點。

圖1 各樣品TLC檢識結(jié)果Fig.1 TLC inspection results for each sample

2.2 各樣品對MCF-7細胞抑制作用比較 MTT法檢測各樣品對MCF-7細胞的抑制作用，以IC50＜30μg·mL-1為有效樣品，舍棄 IC50＞30μg·mL-1的樣品分析結(jié)果，認為 INE1、ILO1、IMA1、IRU1、IMS1 能夠抑制 MCF-7 細胞生長，其中 IMA1（IC50=8.29μg·mL-1）抑制作用最強（P＜0.05）。 見表 1。

2.3 UPLC分析 由MTT檢測結(jié)果得出，13種香茶菜屬樣品中IMA1具有較高活性，且大萼香茶菜為《浙江省中藥炮制規(guī)范（2015版）》[7]規(guī)定的中藥香茶菜藥材來源植物之一，故以UPLC對IMA1進行了梯度分析，為GSH探針分析實驗摸索條件。結(jié)果表明，IMA1共有13種主要化學(xué)成分（峰1～峰13），其中峰1、峰 2、峰 3、峰 6、峰 7、峰 12、峰 13 含量較高。見圖 2。

表1 各樣品對MCF-7細胞增殖抑制作用比較（±s，n=3）Fig.1 Comparison of the proliferation inhibitory ability of Isodon species on MCF-7 cells(±s,n=3)

表1 各樣品對MCF-7細胞增殖抑制作用比較（±s，n=3）Fig.1 Comparison of the proliferation inhibitory ability of Isodon species on MCF-7 cells(±s,n=3)

注：與 IMA1 比較，*P＜0.05Note:Compared with IMA1,*P＜0.05

序號樣品IC50（μg·mL-1）1 INE1 13.1*2 ILO1 24.8*3 IMA1 8.29 4 IRU1 14.7*5 IMS1 17.7*

圖2 220nm下的IMA1 UPLC分析圖譜Fig.2 UPLC analysis spectrum of IMA1 at 220nm

2.4 GSH探針分析 實驗組將IMA1與GSH探針結(jié)合，通過UPLC分析得到圖3A；陰性對照將IMA1與Tris-HCl結(jié)合，通過UPLC分析得到圖3B。進一步與陰性對照峰面積的差異進行比較，判斷其中是否存在邁克爾受體分子類物質(zhì)，其中峰1、峰2和峰3顯著增加，峰4、峰5略微減小，峰6、峰7完全消失，峰8、峰9有所減小，峰11、峰12未完全消失，由此判斷這些化合物與GSH發(fā)生了不同程度的邁克爾加成反應(yīng)，峰1、峰2和峰3為邁克爾加成產(chǎn)物，峰4、峰5、峰 6、峰 7、峰 8、峰 9、峰 11、峰 12 為邁克爾受體分子。見圖3C。

3 討論

本研究選用了浙江省主產(chǎn)的7種香茶菜屬植物樣本的地上部分和地下部分，因線紋香茶菜野外資源稀少，能夠采集到的數(shù)量有限，且其植株柔弱，地下部分為極細小的須根，無法制備足夠的樣品，因此共制備了13個樣品。經(jīng)化學(xué)成分比對分析，確定了不同種香茶菜屬植物化學(xué)成分的差異，并通過MTT法檢測其對人源乳腺癌細胞MCF-7的抑制活性，結(jié)果提示這些植物的地上部分均有一定抗腫瘤活性，其中大萼香茶菜地上部分抗腫瘤活性最強。TLC結(jié)果表明，不同香茶菜屬植物乙酸乙酯提取部位化學(xué)成分大部分相同，但大萼香茶菜的地上與地下部分與其他香茶菜屬植物比較卻有明顯差異，筆者認為這正是大萼香茶菜提取物抗腫瘤效果優(yōu)于同屬其他樣品的物質(zhì)基礎(chǔ)。進一步以GSH為探針，將IMA1與GSH共同孵育，通過比較化學(xué)成分的變化，特異性識別大萼香茶菜中的邁克爾受體分子類物質(zhì)。容易發(fā)生加成反應(yīng)的邁克爾受體分子具有較強的親電性，容易與受體氨基酸發(fā)生作用，從而體現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性。劉建群等[16]研究表明，邁克爾加成反應(yīng)速率可能與抗腫瘤活性存在正相關(guān)性，因此圖3中峰6和峰7化合物可能具有較好的抗腫瘤活性，值得關(guān)注。

圖3 GSH探針孵育后UPLC分析Fig.3 UPLC analysis after GSH probe incubation

香茶菜屬植物中大量含有的貝殼杉烷型二萜類成分是其抗腫瘤藥效物質(zhì)，該類成分是一類邁克爾受體分子，由GSH探針結(jié)合反應(yīng)可知，IMA1中含有可與GSH上的游離巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)的物質(zhì)，能夠使得細胞中GSH水平降低[17]。已有研究表明，香茶菜屬植物富含對映貝殼杉烷型二萜，該二萜具有α-β不飽和羰基單元，為一類邁克爾受體分子[18]。GSH為親核試劑，可以和該類成分發(fā)生加成反應(yīng)，因此初步判斷IMA1中的這些邁克爾受體分子為對映貝殼杉烷型二萜類，正是由于該類成分的存在使得IMA1表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。同時本研究結(jié)果表明該方法可快速發(fā)現(xiàn)該屬中邁克爾受體分子，為后續(xù)針對性分離和鑒定這些活性成分奠定了基礎(chǔ)，并為香茶菜屬植物資源的研究開發(fā)與合理利用提供了科學(xué)依據(jù)。