(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1.心內(nèi)科，2.病理科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

糖尿病是危害人類健康的全球性疾病，預(yù)計(jì)到2030年患病人數(shù)將超過5.5億[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病與非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生密切相關(guān)。已知在一般人群中，NAFLD患病率在13%～15%之間，而糖尿病NAFLD的患病率則迅猛增加至70%[3-5]，研究糖尿病NAFLD發(fā)病機(jī)制意義重大。AGEs是糖毒性的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，在糖尿病相關(guān)并發(fā)癥中作用顯著[6-7]；但AGEs在其重要代謝器官肝臟NAFLD發(fā)病中的作用尚不明晰。因此，我們擬通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討AGEs關(guān)鍵活性成分Nε-羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyl-Lysine，CML)在糖尿病性非酒性脂肪肝中的作用，以期為防治非酒精性脂肪提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；CML購(gòu)自Toronto公司；油酸、棕櫚酸購(gòu)自Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自維森特公司；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；兔/鼠通用型Streptavidin-HRP試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HepG2細(xì)胞在高糖DMEM培養(yǎng)基含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素溶液，溫度為37 ℃、含5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞成片生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳捌浞纸M如下：對(duì)照組(10%FBS高糖DMEM)，F(xiàn)FA組(10%FBS高糖DMEM+0.5 mmol/L FFA)，CML低劑量組(10% FBS高糖DMEM+0.5 mmol/L FFA+10 μmol/L CML)，CML高劑量組(10% FBS高糖DMEM+0.5 mmol/L FFA+100 μmol/L CML)。干預(yù)24h后進(jìn)行油紅O染色以及油紅萃取實(shí)驗(yàn)。

1.3 油紅染色以及油紅萃取實(shí)驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞以1×105每孔種于6孔板中誘導(dǎo)24 h后，PBS潤(rùn)洗2遍，用60%異丙醇將每個(gè)孔潤(rùn)洗一遍，每孔加入1 mL油紅O染色液，染色15 min后，使用60%異丙醇再次潤(rùn)洗一遍，使用蘇木素染色1 min，置于顯微鏡下觀察。每孔加入1 mL異丙醇萃取細(xì)胞內(nèi)的油紅O染色液，每孔100 μL加入96孔板中，于510 nm處測(cè)定其吸光度。

1.4 動(dòng)物模型建立及分組

6周齡ApoE-/-雄性小鼠購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。ApoE-/-小鼠予腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg/d連續(xù)注射5天。2周后將血糖水平≥300 mg/dL的小鼠納入本研究。20只6周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組(普食+尾靜脈注射生理鹽水，n=5)，模型組(高脂飲食+尾靜脈注射生理鹽水，n=5)，CML低劑量組(高脂飲食+尾靜脈注射CML5mg/kg/day，n=5)，CML高劑量組(高脂飲食+尾靜脈注射CML 10 mg/kg/day，n=5)喂養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠眼球摘除眶后取血，用于檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。剝離出肝臟組織，多聚甲醛固定肝臟組織并進(jìn)行組織石蠟切片。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)

小鼠進(jìn)行眶后取血后，室溫靜置1h后，收集上層血清，使用相關(guān)試劑盒檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)按照試劑盒說明書操作。

1.6 肝臟HE染色

采用常規(guī)HE染色法，以4%的多聚甲醛固定，制備石蠟包片，連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化、抗原修復(fù)后。按照兔/鼠通用型Streptavidin-HRP試劑盒說明書進(jìn)行CML免疫組化染色，顯微鏡下觀察，并通過Image J進(jìn)行統(tǒng)計(jì)定量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CML促進(jìn)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

通過油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況(如圖1)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)FA組脂滴數(shù)目增加(如圖1A、1B)，加入不同濃度CML后，顯著增加了細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量(如圖1C、D)。

2.2 肝組織中CML的累積

為進(jìn)一步驗(yàn)證CML是否累積在肝組織中，我們通過CML免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)肝臟中CML含量(如圖2)，我們發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組，HFD組CML染色強(qiáng)度稍增強(qiáng)，隨著小鼠尾靜脈CML給藥濃度的增加，肝臟內(nèi)CML染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。

圖1 CML對(duì)FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積油紅O染色(400×)A：對(duì)照組；B：FFA組；C：CML低劑量組；D：CML高劑量組與對(duì)照組比較，*P<0.05，與FFA組比較,#P<0.05，與CML低劑量組相比，▲P<0.05(n=3)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠肝臟CML含量累積圖片(400×)A：對(duì)照組；B：FFA組；C：CML低劑量組；D：CML高劑量組與對(duì)照組比較，*P<0.05，與HFD組比較,#P<0.05，與CML低劑量組相比，▲P<0.05

2.2 CML促進(jìn)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠脂代謝紊亂

通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)CML加重FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。與此同時(shí)，我們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)上，我們發(fā)現(xiàn)HFD組小鼠血清中TC，TG水平明顯升高，CML處理后小鼠血清中TC，TG水平進(jìn)一步升高。并且這種改變與CML濃度變化相關(guān)(如圖3)。

圖3 CML促進(jìn)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠脂代謝紊亂(n=5)ApoE-/-小鼠連續(xù)喂養(yǎng)8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后ApoE-/-小鼠眶后取血，檢測(cè)血脂(TC、TG)水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05，與HFD組比較，#P<0.05，與CML低劑量組相比，▲P<0.05

2.3 CML加重高脂飲食的ApoE-/-小鼠肝臟損傷以及肝臟脂肪樣變

與對(duì)照組相比，HFD組血清中ALT、ALT活性升高，CML處理后血清中AST、ALT活性明顯升高，進(jìn)一步加重肝臟損傷(圖4)肝臟HE染色顯示對(duì)照組肝葉結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，肝細(xì)胞成放射狀分布，與對(duì)照組相比HFD組肝葉紊亂，可見空泡樣結(jié)構(gòu)，CML組與HFD組相比肝葉結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不清，肝細(xì)胞內(nèi)可見融合成片的空泡樣結(jié)構(gòu)(如圖5)。

圖4 CML濃度依賴性促進(jìn)高脂喂養(yǎng)APOE-/-小鼠肝臟損傷(n=5)ApoE-/-小鼠連續(xù)喂養(yǎng)8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠眶后取血，檢測(cè)肝酶(AST、ALT)水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05，與HFD組比較，#P<0.05，與CML低劑量組相比，▲P<0.05

圖5 CML濃度依賴性促進(jìn)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠肝臟脂肪變性肝臟組織HE染色(200×)觀察肝臟病理變化A：對(duì)照組；B：HFD組；C：CML低劑量組；D：CML高劑量組

2.4 CML加重高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠肝組織內(nèi)氧化損傷

與對(duì)照組比較，HFD組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px含量顯著減低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與HFD組比較，CML組肝組織中SOD及GSH-Px含量進(jìn)一步降低(P<0.05)，MDA含量進(jìn)一步升高(P<0.05)(如圖6)。

圖6 CML濃度依賴性促進(jìn)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠肝組織內(nèi)氧化損傷(n=5)ApoE-/-小鼠連續(xù)喂養(yǎng)8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠眶后取血，檢測(cè)SOD、GSH-Px、MDA水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05，與HFD組比較，#P<0.05，與CML低劑量組相比，▲P<0.05

3 討 論

糖尿病患者多合并NAFLD發(fā)生[8]，但由于早期癥狀體征不明顯往往不易察覺，即使患者確診合并NAFLD的發(fā)生，但是部分患者肝酶水平未見明顯異常，因此往往造成患者漏診[9]。糖尿病合并NAFLD發(fā)生的患者，其心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。[10-11]

NAFLD是以肝臟細(xì)胞空泡性、彌漫性樣變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)的肝臟疾病。近年來NAFLD的患病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)在西方國(guó)家多達(dá)30%的成年人患有NAFLD[12]。而NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚不清楚。“二次打擊”是目前學(xué)術(shù)界普遍接受NAFLD發(fā)病機(jī)制假說。其中第一次打擊主要包括肝臟內(nèi)脂質(zhì)的累積，第二次打擊主要是在脂質(zhì)過量累積的基礎(chǔ)上肝細(xì)胞的氧化損傷。氧化損傷在NAFLD形成中發(fā)揮重要作用，因此抑制氧化損傷也是防治NAFLD的重要途徑。

為探究CML在糖尿病性非酒性脂肪肝中的作用。我們用HepG2建立體外模型，研究發(fā)現(xiàn)CML加重FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，并且這種作用依賴于CML濃度變化。為進(jìn)一步探究CML如何促進(jìn)NAFLD形成。我們以ApoE-/-小鼠構(gòu)建體內(nèi)模型，在體內(nèi)模型中我們發(fā)現(xiàn)CML可明顯加重高脂誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠血清TC、TG水平，肝臟HE顯示CML作用下肝臟組織可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)。CML刺激下ApoE-/-小鼠血清中AST、ALT水平明顯增加。氧化損傷反應(yīng)是NAFLD重要的發(fā)病機(jī)制之一，GSH-Px以及SOD可效清除肝組織內(nèi)的自由基的產(chǎn)生，減少氧化損傷，是肝組織內(nèi)抑制氧化損傷反應(yīng)的重要組成部分[13]。而MDA作為一種強(qiáng)毒力的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平能反映氧化損傷程度，參與NAFLD的進(jìn)展[14]。為探究CML是否通過加重氧化損傷促進(jìn)NAFLD的形成。我們檢測(cè)了血清中SOD、MDA、GSH-Px水平。結(jié)果顯示，CML明顯上調(diào)MDA的表達(dá)，抑制SOD、GSH-Px的表達(dá)。

我們通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了CML通過促進(jìn)脂質(zhì)累積、加重氧化損傷進(jìn)而促進(jìn)NAFLD的形成。CML可能作為糖尿病患者NAFLD形成的危險(xiǎn)因素,這為糖尿病患者早期預(yù)防非酒精性脂肪肝的形成提供了新策略。