(滄州市中心醫(yī)院婦一科，河北 滄州 061000)

宮頸癌是是臨床上最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有年輕化的趨勢[1-2]。雖然通過早期篩查和治療，宮頸癌的發(fā)病率有逐年降低的趨勢，但其仍然是臨床導(dǎo)致死亡的主要腫瘤[3]。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一類由18～24個(gè)單核苷酸所組成的非編碼的RNA，對基因的表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，而miR-4262是最常見的miRNA之一，其水平與多種惡性腫瘤的發(fā)病及治療密切相關(guān)。miR-4262在多種腫瘤中被鑒定為腫瘤啟動子，而低水平的miR-4262預(yù)示著腫瘤患者預(yù)后較差，miR-4262可以靶向原癌基因cd163抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[4-5]。Kaiso是BTB/POZ蛋白家族的成員，可以通過形成抑制復(fù)合物對目標(biāo)基因表達(dá)等環(huán)節(jié)進(jìn)行抑制，且對Wnt信號通路有正性調(diào)節(jié)作用[6]。β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵分子，與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程密切相關(guān)[7]。本研究分析miR-4262抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的Kaiso-β-catenin機(jī)制，為臨床治療及藥物研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及分組

宮頸癌Hela細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞所；培養(yǎng)基及太牛血清均購自Hyclone公司；pGL3-miR-4262表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。Bax/Bcl2及Caspase3一抗購自Santa Cruz公司；Kaiso一抗購自R&D公司；β-catenin及Axin一抗購自CST公司。將miR-4262表達(dá)載體pGL3-miR-4262表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela宮頸癌細(xì)胞株作為miR-4262組，以未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pGL3空載體細(xì)胞分別作為空白組和陰性組。分析各組細(xì)胞處理24 h及48 h后細(xì)胞增殖的抑制情況，分析細(xì)胞處理48 h后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.2 MTT法

miR-4262pGL3載體構(gòu)建過程：擴(kuò)增引物為正向5′-TGCGGGACATTCAGA-3′，反向5′-GGAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，步驟為擴(kuò)增miR-4262序列-連接pMD 18-T轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆-PCR擴(kuò)增特異性片段并測序確認(rèn)-PCR擴(kuò)增酶切連接pGL3載體。轉(zhuǎn)化篩選陽性克隆測序確認(rèn)。將miR-4262表達(dá)載體pGL3-miR-4262表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela宮頸癌細(xì)胞株作為miR-4262組，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已表明4 μg左右的質(zhì)粒量具有明顯的效果，正式試驗(yàn)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的量為4 μg。以未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pGL3空載體細(xì)胞分別作為空白組和陰性組。分別于處理后的第24 h及48 h輕輕棄去各組細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入200 μL的MTT繼續(xù)于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。無菌磷酸鹽緩沖液沖洗后在各組細(xì)胞中加入二甲基亞砜，震蕩處理。用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)板各個(gè)培養(yǎng)孔的吸光度值，并計(jì)算抑制率。細(xì)胞的增殖抑制率=(對照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/對照組OD值×100%。

1.3 Western Blotting法

各組細(xì)胞處理后提取細(xì)胞的總蛋白并進(jìn)行定量。以等量總蛋白上樣后進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束后小心取下凝膠并進(jìn)行半干法PVDF轉(zhuǎn)膜(300 mA，45 min)。轉(zhuǎn)膜后用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗。5%的胎牛血清進(jìn)行膜封閉10 min。室溫條件下將PVDF膜與第一抗體(400×)孵育60 min，無菌PBS沖洗(5 min×3次)后，與二抗(800×)孵育60 min。PBS沖洗3次后顯色，拍照。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行蛋白表達(dá)的相對定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，總體比較有差異再采用LST-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-4262抑制宮頸癌細(xì)胞增殖效果分析

與空白組和陰性組相比，miR-4262組細(xì)胞的抑制率明顯升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-4262抑制宮頸癌細(xì)胞增殖效果分析與對照組比較，*P<0.05；與陰性組比較，#P<0.05

2.2 各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

與空白組和陰性組比較，miR-4262組細(xì)胞的Bax和Caspase3表達(dá)明顯升高而Bcl2表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖2、表1。

圖2 各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)分析

2.3 各組細(xì)胞中Kaiso、β-catenin及Axin蛋白的表達(dá)

與空白組和陰性組比較，miR-4262組細(xì)胞的Kaiso、β-catenin表達(dá)明顯升高而Axin表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖3、表2。

表1 各組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)分析

與對照組比較，aP<0.05；與陰性組比較，bP<0.05

圖3 各組細(xì)胞中Kaiso、β-catenin及Axin蛋白的表達(dá)分析

表2 各組細(xì)胞中Kaiso、β-catenin及Axin蛋白的表達(dá)分析

與對照組比較，aP<0.05；與陰性組比較，bP<0.05

3 討 論

宮頸癌是婦科臨床最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致死亡的最常見惡性腫瘤之一。微小RNA在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡化過程密切相關(guān)，且與藥物的治療效果密切聯(lián)系。miR-4262為腫瘤發(fā)生的啟動子，且證據(jù)顯示胃癌患者的胃組織中的miR-4262明顯下調(diào)，在晚期胃癌中，MIR-4262的水平顯著降低。較低水平的miR-4262可預(yù)測胃癌患者預(yù)后較差，而miR-4262可靶向原癌基因CD163，抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[8]。micrornas(mirs)水平和功能的改變與致癌有關(guān)。在分析miR-4262在人類皮膚惡性黑色素瘤(CMM)細(xì)胞增殖中的作用和潛在機(jī)制中發(fā)現(xiàn)KLF6在CMM細(xì)胞中起著腫瘤增強(qiáng)因子的作用，而MIR-4262通過KLF6介導(dǎo)的EGFR失活和p21上調(diào)促進(jìn)CMM細(xì)胞的增殖[9]。在研究miR-4262對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制時(shí)也證實(shí)異常表達(dá)的miR-4262可能通過galnt4影響人結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和增殖，這似乎是一個(gè)有希望的結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)[10]。本研究在分析miR-4262抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的Kaiso-β-catenin機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-4262組細(xì)胞的抑制率明顯升高，Bax和Caspase3表達(dá)明顯升高而Bcl2表達(dá)明顯降低，且Kaiso、β-catenin表達(dá)明顯升高而Axin表達(dá)明顯降低，miR-4262能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，且其作用可能與調(diào)節(jié)Kaiso-β-catenin信號通路蛋白表達(dá)有關(guān)。

Kaiso蛋白為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)蛋白，其水平的異常與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡過程密切相關(guān)。Kaiso和p120ctn在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，二者可能共同參與胃癌的發(fā)生及分化，且Kaiso通過調(diào)控連環(huán)蛋白P120ctn及參與Wnt信號通路的激活調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。異常的經(jīng)典的Wnt信號通路的激活可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，P120連環(huán)蛋白/轉(zhuǎn)錄抑制因子Kaiso對Wnt信號通路的靶基因具有調(diào)控作用，影響Wnt信號通路從而影響腫瘤發(fā)生的過程[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)miR-4262組細(xì)胞的抑制率明顯升高，Kaiso表達(dá)明顯升高且細(xì)胞凋亡明顯，miR-4262能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖可能與調(diào)節(jié)Kaiso蛋白表達(dá)有關(guān)。Wnt/β-catenin信號通路也是藥物干預(yù)治療惡性腫瘤的重要靶點(diǎn)[13-14]。RACK1和β-catenin蛋白異常表達(dá)可能與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)，并影響子宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15]，抑制宮頸癌細(xì)胞STIM1基因表達(dá)可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路降低癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[16]。β-Catenin在ESCC不同分化組間的表達(dá)存在水平差異，可為ESCC的預(yù)后評估提供參考[17]，TRPM3可能通過激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移的能力[18]。

因此，miR-4262能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，且其作用可能與調(diào)節(jié)Kaiso-β-catenin信號通路蛋白表達(dá)有關(guān)。但本文僅觀察了24 h及48 h腫瘤細(xì)胞的增殖情況，且發(fā)現(xiàn)48 h時(shí)各組細(xì)胞的抑制率差異顯著，故未再延長觀察時(shí)間，今后的研究有待進(jìn)一步延長觀察時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，在以后的研究中將對體內(nèi)不同臨床分期及類型的宮頸癌樣本進(jìn)行病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析，分析Kaiso-β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)的定位及表達(dá)，為臨床更合理的診斷及治療提供參考。