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(1. 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)組胚教研室, 湖南 衡陽 421001)

膀胱癌屬于比較常見的泌尿外科腫瘤，發(fā)病率逐年上升。近年來淺表性膀胱癌仍然是在腫瘤電切術(shù)的基礎(chǔ)上，膀胱灌注卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)進(jìn)行免疫治療或化療藥物灌注治療。一系列病理生理學(xué)和免疫學(xué)研究表明，BCG通過誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，激活機(jī)體免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。資料[1-2]表明，膀胱灌注BCG后復(fù)發(fā)率較高。人們?yōu)榇藝L試不同的藥物，以期改善膀胱癌的治愈率。腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展與腫瘤免疫密切相關(guān)。青藤堿(Alkaloid sinomenine，SIN)是從青風(fēng)藤提取出來的有效活性單體，已被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[3-6]。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，MNU和N-正丁基-N-(4-羥基-丁基)亞硝胺(BBN)均屬于強(qiáng)致癌劑，通常應(yīng)用于大鼠膀胱灌注誘癌，其中BBN組誘癌率72.7%，而MNU組誘癌率達(dá)94.4%。本研究建立大鼠膀胱癌模型，探討膀胱灌注SIN對(duì)大鼠膀胱癌的腫瘤免疫的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買75只清潔級(jí)雄性SD大鼠，均為18～20個(gè)月齡，體重均為250～270g。購(gòu)入后將其放入飼養(yǎng)籠，動(dòng)物房?jī)?nèi)保持清潔，并且通風(fēng)良好，保持溫度恒定(23～25 ℃)、相對(duì)濕度恒定(40%～60%)，喂養(yǎng)食物為顆粒等級(jí)飼料，水源為自來水，使其適應(yīng)一周后方進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守并執(zhí)行南華大學(xué)頒發(fā)的《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理準(zhǔn)則》。

1.2 主要藥品

N-甲基亞硝基脲(Solarbio)、鹽酸青藤堿粉劑(湖南正清制藥有限公司)、BCG凍干制劑(瑞楚制藥)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 配制MNU液、BCG溶液和青藤堿溶液 按照王藝臻[8]的MNU配制方法，將1.0 g MNU溶入50 mL枸櫞酸鈉緩沖液，充分溶解后置入20 ℃冰箱避光保存；將50 mg BCG凍干制劑分別溶入20 mL、40 mL生理鹽水，分別配制成1.25 mg/mL、2.5 mg/mL等2個(gè)濃度。按照屈紹思[9]的實(shí)驗(yàn)方法，將青藤堿粉劑加入生理鹽水，配置成40 mg/mL的青藤堿溶液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組和大鼠膀胱癌模型的建立 將SD大鼠分為5組，每組15只。分為對(duì)照組、模型組、青藤堿組、青藤堿+1/2 BCG組、BCG組等5組。除了對(duì)照組，其他四組共計(jì)60只大鼠參考王藝臻[8]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，建立大鼠膀胱癌模型。大致過程如下：以20 mg/kg的劑量向大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥液進(jìn)行麻醉，滿意后將大鼠固定，碘伏消毒尿道口，采用5 cm硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道口垂直插入，至硬膜外導(dǎo)管內(nèi)可見尿液滴出，證實(shí)硬膜外導(dǎo)管順利抵達(dá)膀胱。取胰島素注射器作為膀胱灌注的推藥器具，從硬膜外導(dǎo)管遠(yuǎn)端緩緩注入0.1 mL MNU溶液進(jìn)行膀胱灌注(灌注時(shí)程為每2周1次，持續(xù)10周)。操作結(jié)束后，放回飼養(yǎng)籠中。

10周后，對(duì)照組和模型組以生理鹽水每只0.2 mL按照如上操作方法進(jìn)行膀胱灌注處理；青藤堿組膀胱灌注0.2 mL青藤堿溶液；青藤堿+1/2 BCG組在青藤堿組基礎(chǔ)上，同時(shí)加用濃度1.25 mg/mL的BCG 0.2 mL膀胱灌注；BCG組給予濃度2.5 mg/mL BCG 0.2 mL膀胱灌注。以上操作均每周1次，持續(xù)4周。14周后采用頸椎脫臼法處死大鼠后，迅速移除腹腔內(nèi)容物，從大鼠下腔靜脈無菌采血，分離血清，-20 ℃環(huán)境保存；摘取膀胱后，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般生活情況 每日觀察大鼠毛色，以及大鼠一般行為，如進(jìn)食、飲水等。

1.4.2 采用熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time PCR)檢測(cè)膀胱組織CTLA-4和PD-1 嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟，經(jīng)過勻漿、吸打、離心、純化RNA等，提取樣本總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后進(jìn)行擴(kuò)增，熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR，采用相對(duì)定量計(jì)算公式進(jìn)行定量分析。

1.4.3 蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)測(cè)定膀胱組織CTLA-4和PD-1 嚴(yán)格參照操作要求，經(jīng)過配制工作液、提取總蛋白、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉與抗體孵育和顯影等步驟，最后用凝膠成像系統(tǒng)成像，再用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，得到目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度比值，即為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)值。

1.4.4 采用ELISA法測(cè)定大鼠血清B7/H3的表達(dá) 采用雙抗體夾心法，按照說明書要求，依次經(jīng)過包被-加樣-加酶標(biāo)抗體-加底物液顯色-終止反應(yīng)-結(jié)果判定等一系列過程，在波長(zhǎng)450 nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。

1.4.5 采用HE染色法進(jìn)行大鼠膀胱組織病理檢查 依次經(jīng)過甲醛固定、各梯度乙醇脫水、二甲苯透明化、滴蠟包埋、切片、脫蠟、脫二甲苯、洗滌、蘇木素染色、伊紅染色、脫水、透明化和封片處理后，使用400倍光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。病理結(jié)果描述參照《KOSS診斷細(xì)胞學(xué)及其組織病理學(xué)基礎(chǔ)》，采用HE染色評(píng)分進(jìn)行分類及分級(jí)：0分提示未見癌組織；0.5分為輕微增生；1分為上皮無異型性或者僅為輕度異型性、輕度增生者；2分為上皮中度增生、異型性；3分為重度增生、高度異型性；4分對(duì)應(yīng)乳頭狀癌；5分提示腫瘤浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。膀胱炎癥評(píng)分：0分提示無炎癥；1分提示膀胱表面和微血管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2分提示膀胱組織內(nèi)可見炎細(xì)胞1～20個(gè)/片；3分提示膀胱組織內(nèi)可見炎細(xì)胞21～100個(gè)/片；4分提示膀胱組織內(nèi)可見炎細(xì)胞大于100個(gè)/片。將各組相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)累加，即為病理學(xué)總評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況

觀察到第14周，大鼠均無死亡現(xiàn)象發(fā)生。對(duì)照組、青藤堿+1/2BCG組及BCG組大鼠毛色光滑，進(jìn)食正常，對(duì)外來刺激敏感；模型組和青藤堿組大鼠欠光滑，進(jìn)食量及飲水量均有所減少，對(duì)外來刺激反應(yīng)稍顯遲鈍。

2.2 各組大鼠檢測(cè)結(jié)果比較

5組大鼠的CTLA-4mRNA，對(duì)照組顯著低于其余各組(P<0.05)，而模型組顯著高于其余各組(P<0.05)；BCG組顯著低于青藤堿組(P<0.05)；青藤堿+1/2BCG組、BCG組比較差異無顯著性(P>0.05)。5組大鼠的PD-1mRNA，對(duì)照組顯著低于其余各組(P<0.05)，而模型組顯著高于其余各組(P<0.05)；青藤堿+半量BCG組、BCG組顯著低于青藤堿組(P<0.05)；青藤堿+1/2BCG組、BCG組比較差異無顯著性(P>0.05)。5組大鼠的B7-H3蛋白，對(duì)照組顯著低于其余各組(P<0.05)；青藤堿+半量BCG組、BCG組顯著低于模型組、青藤堿組(P<0.05)；青藤堿+1/2BCG組、BCG組比較差異無顯著性(P>0.05)。詳見表1、圖1。

圖1 各組CTLA-4、PD-1表達(dá)比較

表1 各組大鼠各指標(biāo)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與青藤堿組比較，cP<0.05.(n=15)

2.3 各組大鼠病檢結(jié)果比較

對(duì)照組未見細(xì)胞異型性，評(píng)分0.79±0.31；模型組細(xì)胞排列紊亂，多數(shù)高度異型增生并中-重度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，評(píng)分3.18±1.33；青藤堿組細(xì)胞排列紊亂，部分為高度異型增生，多數(shù)為中度異型增生，評(píng)分2.31±0.84；青藤堿+1/2BCG組細(xì)胞排列紊亂，多數(shù)為中度異型增生伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，評(píng)分為1.39±0.65；BCG組細(xì)胞排列紊亂，多數(shù)為輕-中度異型增生伴輕度-中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，評(píng)分1.16±0.52。對(duì)照組評(píng)分顯著低于其余各組(P<0.05)；模型組顯著高于其余各組(P<0.05)；青藤堿組顯著高于青藤堿+1/2BCG組、BCG組(P<0.05)；青藤堿+1/2BCG組、BCG組相比差異無顯著性(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組病理學(xué)改變(HE染色法×400)A：對(duì)照組;B：模型組;C：青藤堿組;D：青藤堿+1/2BCG組;E：BCG組

3 討 論

近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑如抗細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA-4)、抗程序性死亡受體1(PD-1)和抗程序性死亡配體1 (PD-L1)等用于治療腫瘤具有非常光明的前景[10]。CTLA-4不僅可與CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合APC表面的B7分子配體，抑制免疫細(xì)胞共刺激信號(hào)，還可產(chǎn)生其他抑制性信號(hào)，抑制CTL的增殖與活化，最終產(chǎn)生的效應(yīng)為抗腫瘤作用大大減弱[11]。因此，如果CTLA-4過度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的活化受到抑制，腫瘤細(xì)胞無法得到有效殺傷，從而使其達(dá)到免疫逃逸的目的。反之，抑制CTLA-4的表達(dá)可降低CTLA-4與B7結(jié)合的親和力，使得T細(xì)胞的活性大為增強(qiáng)，機(jī)體抗腫瘤免疫能力大大增強(qiáng)[12]。本研究中各組大鼠致癌后，大鼠膀胱組織CTLA-4蛋白顯著增高，提示大鼠患膀胱癌，機(jī)體的免疫功能失衡。對(duì)致癌大鼠分別應(yīng)用SIN、BCG或SIN聯(lián)合半量BCG進(jìn)行膀胱灌注，大鼠膀胱組織CTLA-4蛋白表達(dá)量均顯著下降，提示上述各干預(yù)措施對(duì)大鼠膀胱癌細(xì)胞增殖都起到了一定的抑制作用。而將SIN、BCG或SIN聯(lián)合半量BCG進(jìn)行膀胱灌注的各組大鼠進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)SIN聯(lián)合半量BCG進(jìn)行膀胱灌注的大鼠膀胱組織與CTLA-4和BCG進(jìn)行膀胱灌注的大鼠對(duì)比差異無顯著性，表明了SIN和BCG進(jìn)行膀胱灌注療效具有協(xié)同性，提示了SIN可作為治療膀胱癌的有效輔助用藥。本研究的SIN濃度的配置參考了屈紹思[8]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度，考慮到該文獻(xiàn)中高濃度SIN組大鼠出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，且不能明確是否屬于SIN的毒副作用，因此將其中等濃度SIN作為本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度。

PD-1/PD-L1抑制劑與CTLA-4抑制劑效果相似，能夠抑制T細(xì)胞的活化與增殖，但在作用機(jī)制上兩者有所不同。CTLA-4抑制劑主要在T細(xì)胞活化的早期起作用，而PD-1抑制劑主要作用于T細(xì)胞活化的晚期。與CTLA-4相比，PD-1的抑制作用更強(qiáng)。PD-1是T細(xì)胞上主要存在的一種抑制性受體，腫瘤發(fā)生時(shí)機(jī)體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境會(huì)使浸潤(rùn)性T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，同時(shí)腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)上調(diào)，與PD-1受體相結(jié)合，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1通路持續(xù)開放，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞則逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，發(fā)生腫瘤免疫逃逸[13]，因此通過抑制PD-1的表達(dá)可阻斷以上生物過程，達(dá)到增強(qiáng)免疫活性來殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)[14]。有學(xué)者研究將PD-1/PD-L1抑制劑應(yīng)用于膀胱癌患者，發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑能顯著延長(zhǎng)膀胱癌患者總體生存期[15-17]。本研究中各組大鼠膀胱癌組織PD-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出與CTLA-4蛋白相似的趨勢(shì)，提示對(duì)致癌大鼠分別應(yīng)用SIN、BCG或SIN聯(lián)合半量BCG進(jìn)行膀胱灌注，大鼠膀胱組織CTLA-4蛋白表達(dá)量均顯著下降，提示上述各干預(yù)措施對(duì)大鼠膀胱癌細(xì)胞增殖都起到了一定的抑制作用。B7-H3也是近年來興起的研究較熱的免疫檢查點(diǎn)分子之一。我國(guó)最近的一項(xiàng)臨床研究中，證實(shí)了B7-H3在大多數(shù)NSCLC患者的血液中高表達(dá)，并且與預(yù)后差有關(guān)[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)了其在非小細(xì)胞肺癌患者的惡性胸腔積液中普遍高表達(dá)，且與預(yù)后差相關(guān)[19]。本研究中各組大鼠致癌后，大鼠血清B7-H3表達(dá)量顯著增高。SIN進(jìn)行膀胱灌注后，大鼠血清B7-H3表達(dá)量均無顯著性變化，提示SIN對(duì)MNU致癌的膀胱癌大鼠進(jìn)行膀胱灌注無法有效降低大鼠血清B7-H3。SIN聯(lián)合半量BCG進(jìn)行膀胱灌注后，大鼠血清B7-H3顯著降低，可能是因?yàn)锽CG發(fā)揮了積極有效的抗腫瘤效應(yīng)。上述結(jié)果可能表明在膀胱癌發(fā)生和進(jìn)展的免疫失衡機(jī)制中，SIN對(duì)于在B7-H3這個(gè)免疫檢查點(diǎn)分子似乎不起作用。這個(gè)研究結(jié)果提示SIN不能顯著降低膀胱癌大鼠血清B7-H3的表達(dá)，反過來驗(yàn)證了腫瘤發(fā)病機(jī)制的多樣性和復(fù)雜性，以及治療腫瘤進(jìn)行聯(lián)合用藥的必要性。

病理學(xué)診斷是診斷腫瘤良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)，直接決定了腫瘤患者的預(yù)后。本研究中，除了正常對(duì)照組沒有建立大鼠膀胱癌模型外，其余建模組均成功致癌。根據(jù)5組病檢總評(píng)分結(jié)果，可見單用SIN進(jìn)行膀胱灌注的15只大鼠病檢結(jié)果較模型組顯著改善，提示對(duì)膀胱癌大鼠給予SIN進(jìn)行膀胱灌注，能有效改善其病理評(píng)分。當(dāng)SIN聯(lián)合半量BCG進(jìn)行膀胱灌注后，病理評(píng)分進(jìn)一步降低，這充分展現(xiàn)了聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)，直觀地體現(xiàn)了SIN在膀胱癌中抗腫瘤的積極效應(yīng)，證實(shí)了SIN能有效改善膀胱癌預(yù)后，是一種治療膀胱癌的有效的化療輔助用藥。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程呈現(xiàn)多通路、多機(jī)制的特點(diǎn)。青藤堿能顯著抑制膀胱癌大鼠CTLA-4、PD-1的表達(dá)，降低膀胱炎癥及HE染色評(píng)分，可能通過下調(diào)膀胱癌的免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)而抑制膀胱癌進(jìn)展。