(1.南華大學附屬第二醫(yī)院眼科,湖南 衡陽 421001；2.鄭州大學信息工程學院計算機科學與技術專業(yè)，河南 鄭州 450001)

糖尿病是一種常見的慢性病，成人患病率為8.5%，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)為常見并發(fā)癥之一，約35%的糖尿病患者受其影響，7%的患者視力受到威脅[1]。DR歷來被視為視網(wǎng)膜血管病變，一系列的病理變化不僅對視網(wǎng)膜造成影響，還會導致血管的損傷。除了視網(wǎng)膜前出血、視網(wǎng)膜新生血管、玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等，糖尿病黃斑水腫(DME)也是糖尿病視網(wǎng)膜病變的一種并發(fā)癥，它的特點是血管通透性增加，以及液體滲出血管導致視網(wǎng)膜細胞外液的異常積聚，從而可能導致失明[2]。原花青素(procyanidin，PC)是飲食中主要的多酚類物質，具有血管舒張、抗氧化、改善內皮功能、抗炎等多種作用[3]。同時，原花青素可抑制血管內皮生長因子(Vascular endogrowth factor, VEGF)信號傳導[4]，而VEGF可刺激血管生成,在胚胎發(fā)育和組織損傷修復過程中，對促進新生血管的形成起著至關重要的作用。在糖尿病患者中，升高的血糖水平會導致許多生化途徑的異常調節(jié)，最終導致視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生超氧化物和氧化應激的負擔。由于線粒體功能障礙、炎癥和缺氧驅動的VEGF分泌導致血管和神經(jīng)細胞凋亡、新生血管和血管通透性升高[5]，從而導致DR相關并發(fā)癥。適當使用眼內給藥抗血管內皮生長因子(Anti-VEGF)可治療及預防視力損害性糖尿病視網(wǎng)膜病變，尤其是糖尿病黃斑水腫(DME)[6]，因此，抗VEGF藥物可降低DR失明的發(fā)生率，其長期療效和安全性已在眾多隨機試驗中得到證實[7]。依據(jù)原花青素相關特性及DR發(fā)病機制，本實驗從建立體外模型來探討原花青素對體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內皮細胞的影響出發(fā)探究其對治療DR的藥用價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清購自sigma公司；原花青素購自株洲遠成合中科技發(fā)展公司；兔抗人VEGF抗體、β-Actin抗體、兔抗人vWF、兔抗山羊Alexa-fluor購自Proteintech公司；胰蛋白酶購自美國sigma公司；高糖培養(yǎng)液(High glucose DMEM)購自Gibco公司；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio公司；RIPA裂解液購自碧云天生物有限公司；SDS和5×SDS上樣緩沖液購自上海生工生物工程有限公司；第Ⅷ因子相關抗原抗體購自Proteintech公司；PVDF膜購自北京利科生化科貿有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HRCECs的培養(yǎng) 無菌手術室獲得人角膜移植術后供體眼球，沿赤道部平行剪開眼球，在顯微鏡下，使用顯微器械鈍性剝取視網(wǎng)膜神經(jīng)層，經(jīng)消化、剪碎、勻漿后，濾網(wǎng)過濾，終止消化并離心，收集細胞，加入細胞培養(yǎng)液(加入了10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、50 u/mL慶大霉素)混勻，接種于培養(yǎng)瓶內，將其置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)細胞，根據(jù)細胞生長情況予以換液，約1～2天換液1次。注意觀察視網(wǎng)膜微血管內皮細胞是否呈梭形貼壁生長，培養(yǎng)瓶中的原代細胞貼壁面積大于80%時予以傳代培養(yǎng)。

1.2.2 HRCECs的鑒定 使用倒置相差顯微鏡觀察HRCECs的生長特性以及形態(tài)特征，將生長狀態(tài)良好的細胞加入培養(yǎng)液制成濃度約4.5×104個/mL的細胞懸液，將無菌蓋玻片置于24孔板內，每孔接種1 mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞爬滿玻片后PBS漂洗細胞2遍，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3遍后加入第Ⅷ因子相關抗原抗體，置于4 ℃環(huán)境下過夜，重復上述漂洗步驟，滴入二抗混合液后漂洗封片，顯微鏡下觀察其表達并采集圖像。

1.2.3 實驗分組 本實驗分組為以下六組：TL組：低糖對照組(葡萄糖濃度為1 g/L)；TH組：高糖對照組(葡萄糖濃度為4.5 g/L)；T1組：高糖+200 μg/mL的原花青素組；T2組：高糖+400 μg/mL的原花青素組；T3組：高糖+600 μg/mL的原花青素組；T4組：高糖+800 μg/mL的原花青素組。

1.2.4 MTT法檢測HRCECs增殖 取培養(yǎng)良好的細胞，棄去上清液后分別加入1 mL高糖培養(yǎng)液及1 mL低糖培養(yǎng)液，制成細胞懸液；將其接種于96孔板，每孔200 μL，約有細胞5×103個；本實驗共有6個分組，每組設置5個復孔，96孔板的邊緣孔只加入培養(yǎng)液作為空白對照以便調零及預防蒸發(fā)。待細胞貼壁時棄去培養(yǎng)液，將配制好的原花青素母液用高糖培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，按實驗分組加藥：TL組每孔加入200 μL低糖培養(yǎng)液；TH組每孔加入200 μL高糖培養(yǎng)液；T1-T4組按照用高糖培養(yǎng)液稀釋好的原花青素濃度分別為(200、400、600、800 μg/mL)加入96孔板，每孔200 μL。將其繼續(xù)分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h。再向每孔加入20 μL的MTT粉劑溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；將培養(yǎng)液吸除后用PBS洗滌3次，再向每孔加入20 μL的DMSO溶液，振蕩10 min至其藍紫色結晶溶解；96孔板放入酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀，選擇波長為490 nm，記錄結果后依據(jù)公式計算：細胞存活率=實驗組(T1-T4組)平均OD值/對照組(TL、TH組)平均OD值×100%；細胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。以上全部步驟重復三次計算最終結果。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測HRCECs的VEGF表達 按照細胞傳代方法，將離心后的細胞棄去上清液后分別用高糖培養(yǎng)液及低糖培養(yǎng)液制備成濃度為4.5×104個/mL的細胞懸液，接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)至細胞貼壁。TL組只加入低糖培養(yǎng)液；TH組只加入高糖培養(yǎng)液；T1-T4組按照原花青素濃度分別為(200、400、600、800 μg/mL)加入高糖培養(yǎng)液，每組2個復孔。分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h后取出用于提取蛋白。將蛋白樣品按分組順序自凝膠凹槽的一側加入，每孔20 μL，第一孔加入5 μL mark及15 μL溴酚藍作為標記，以80 V電壓電泳約30 min至mark紅色標記線出現(xiàn)，再將電壓加大至150 V電泳30 min至標記線到達凝膠下緣或者以蛋白分子量相對應位置為標準后轉膜。將轉膜后的PVDF膜正面朝上置于TBST溶液中清洗數(shù)秒，再放入含5%脫脂牛奶的TBS液體的容器中，低速搖晃2小時；取出PVDF膜吸凈液體，表面滴滿一抗放置4 ℃冰箱中孵育，第二天取出放入TBS于搖床上清洗3次，每次10 min；再次取出吸凈后加入二抗于室溫下孵育1小時。孵育好二抗的PVDF膜用TBS清洗3次，每次10 min，在避光條件下將其放入事先準備好的顯影液中，打開Image lab軟件，放置凝膠、顯影，保存圖片。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 HRCECs的培養(yǎng)和鑒定

原代HRCECs在5%CO2、37℃環(huán)境的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)一至兩天后見細胞開始貼壁生長，在倒置顯微鏡下可見其為扁平梭狀，其中混有多種雜質細胞，根據(jù)細胞生長狀態(tài)予以換液，待細胞培養(yǎng)一至兩周時，雜質細胞已明顯減少，HRCECs呈鋪路石樣鋪滿培養(yǎng)皿底部(圖1)，并出現(xiàn)細胞接觸抑制現(xiàn)象。將原代HRCECs予以1:2比例規(guī)律開始傳代，約1～2天予以換液，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。利用熒光素標記的第Ⅷ因子相關抗原抗體孵育后的人視網(wǎng)膜血管內皮細胞的包漿中可見黃綠色熒光，黑綠色的為胞核，細胞輪廓清楚(圖2)。此現(xiàn)象表示體外培育HRCECs成功。

圖2 HRCECs免疫熒光鑒定(100×)

2.2 HRCECs增殖

將HRECEs細胞接種于96孔板培養(yǎng)，高糖組與對照組(低糖組)之間比較，同一培養(yǎng)時間段，低糖組HRCECs數(shù)量都小于高糖組，其詳細吸光度值見(表1.1);HRCECs經(jīng)過24 h、48 h、72 h培養(yǎng)后，不同濃度原花青素(200、400、600、800 μg/mL)+高糖組不同組別之間兩兩比較，隨著原花青素濃度升高對HRCECs細胞抑制率增加，結果具有顯著性差異(P<0.05)；且受同一濃度的原花青素干預培養(yǎng)的HRCECs，其細胞抑制率隨著藥物干預時間的增加而升高，其詳細吸光度值及細胞抑制率見(表1)。

表1 不同濃度的PC對體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HRCECs增殖的影響 (n=5)

與TL組比較，aP<0.05；與TH組比較，bP<0.05

2.3 不同濃度PC對體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HRCECs中VEGF表達的影響

應用蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測本實驗不同分組HRCECs中VEGF的表達情況：1)HRCECs經(jīng)過同一時間培養(yǎng)后，高糖組HRCECs中VEGF的表達量都高于低糖組，其蛋白條帶灰度值數(shù)據(jù)分析結果具有顯著差異，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2)HRCECs在同一培養(yǎng)時間下，不同濃度原花青素(200、400、600、800 μg/mL)+高糖組不同濃度分組間兩兩比較，HRCECs中VEGF的表達量隨著原花青素濃度升高而降低，結果具有顯著性差異(P<0.05)，且受同一濃度的原花青素干預培養(yǎng)的HRCECs，其VEGF的表達量隨著藥物干預時間的增加而降低。(圖3～5，表2)

圖3 不同濃度PC對高糖環(huán)境下培養(yǎng)24小時HRCECs中VEGF表達

圖4 不同濃度PC對高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時HRCECs中VEGF表達

圖5 不同濃度PC對高糖環(huán)境下培養(yǎng)72小時HRCECs中VEGF蛋白表達

表2 原花青素對分別在24、48、72小時下體外培養(yǎng)的HRCECs中的VEGF表達 (n=5)

與TL組比較，aP<0.05；與TH組比較，bP<0.05

3 討 論

DR的發(fā)病機制尚未完全清楚，高血糖是始動及基礎因素，近年來，隨著分子生物學的研究進展，發(fā)現(xiàn)DR的發(fā)生發(fā)展受多種信號介導，如氧化應激反應增強、線粒體活性氧增多、蛋白激酶C的激活、多元醇通路的過度激活、細胞因子的表達增加等。其中VEGF是高度有效的促血管生成細胞因子，VEGF的表達上調，可誘導新生血管形成并增加血管的通透性，導致視網(wǎng)膜出血、滲出、及新生血管的形成等病理生理改變，其在DR的發(fā)生發(fā)展過程中有著極其重要的作用。據(jù)統(tǒng)計，如果不治療增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR),50%的患者將在確診后5年內失明[8]。因此，對PDR的治療顯得尤為重要?？筕EGF藥物目前是治療DR并發(fā)癥DME及促進眼底新生血管消退的標準藥物[9]，可以抑制血管內皮生長因子(VEGF)的信號傳導[4]，誘導血管內皮細胞凋亡。本研究利用PC干預體外建立高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜內皮細胞培養(yǎng)過程，觀察其可能對DR的治療效果。

高糖環(huán)境下，機體的氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡會被打破，產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)，導致細胞毒性和氧化應激[10]，從而破壞視網(wǎng)膜細胞正常生理功能。氧化應激在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用，在許多與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展相關的異常中，氧化應激處于中心位置[11]。糖尿病患者視網(wǎng)膜中的ROS增加刺激促炎細胞因子的釋放，促進涉及多種信號通路的慢性低級別炎癥，同時導致視網(wǎng)膜內皮細胞損傷，微血管通透性增加，炎癥部位炎癥細胞的聚集，這些炎癥細胞與內皮細胞和視網(wǎng)膜上的其他常駐細胞之間發(fā)生異常的相互作用，通過細胞間分子信號傳導造成視網(wǎng)膜血管結構損害并觸發(fā)血管生成[12]；而PC可以通過減少ROS的過度生成，抑制高糖誘導的血管平滑肌細胞生長[13]，具有良好的體外抗氧化和抗炎活性。研究發(fā)現(xiàn)PC能直接抑制血管生長因子受體-2激酶的活性及內皮細胞中血管生長因子受體/細胞分裂素活化蛋白激酶介導的信號通路途徑，繼而抑制血管內皮細胞增殖和遷移及血管的出芽。NF-κB信號通路存在于多細胞分化和增殖的過程中，PC通過下調NF-κB的表達水平，抑制NF-κB信號通路的激活繼而抑制細胞的增殖[14]。本研究隨著原花青素濃度升高對HRCECs細胞抑制率增加；且受同一濃度的原花青素干預培養(yǎng)的HRCECs，其細胞抑制率隨著藥物干預時間的增加而升高。這提示PC對于體外高糖模型下培養(yǎng)的HRCECs增殖有抑制作用，且呈時間-濃度依賴性。

另一方面，VEGF的高表達被認為是參與視網(wǎng)膜損傷的主要標志物。本實驗中，在高糖環(huán)境下，HRCECs中VEGF表達對比低糖環(huán)境明顯增加，這與報道的在PDR中，高血糖引起的VEGF水平升高致使異常新生血管生成而成為視力下降的一個主要因素相一致[15]，除了促進血管生成，VEGF可能還參與神經(jīng)元損害[16]，進一步危害DR患者的視力。因此，VEGF是治療DR大多數(shù)藥理干預的靶點[17]。本實驗結果表明，HRCECs在同一培養(yǎng)時間下，VEGF的表達量隨著原花青素濃度升高而降低，且受同一濃度的原花青素干預培養(yǎng)的HRCECs，其VEGF的表達量隨著藥物干預的時間的增加而降低。說明PC可以抑制高糖誘導的VEGF的表達，可能作為一種抗VEGF藥物參與DR的治療。