蘭靜 賈雯靖 孫向東 趙琳 金海濤 王冰 張瑞英*

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱150086；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150086；第一作者：15004681709@163.com；*通訊作者：zhruiying@163.com）

水稻是人類的主要糧食作物，尤其亞洲國(guó)家（如中國(guó)、日本、南亞等國(guó)家）多以稻米為主食。在亞洲地區(qū)，大米為當(dāng)?shù)厝丝谔峁└哌_(dá)50%以上的飲食能量需求，占有極高的比例[1-2]。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)稻米的追求逐漸由產(chǎn)量轉(zhuǎn)至食味品質(zhì)[3-4]。影響稻米食味的主要因素是蛋白質(zhì)含量及直鏈淀粉含量等[5]。稻米中的蛋白質(zhì)是公認(rèn)的最優(yōu)植物蛋白[6-7]，具有降低膽固醇和降低體脂等作用[8-9]。蛋白質(zhì)作為稻米品質(zhì)的主要性狀，是稻米品質(zhì)改良不可忽視的重要因子，然而其相關(guān)研究還較為薄弱。水稻蛋白質(zhì)按照功能劃分，可分為貯藏蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。水稻種子中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)是貯藏蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白是維持種子細(xì)胞正常代謝的蛋白，相對(duì)較少。水稻貯藏蛋白質(zhì)主要存在于胚乳，按溶解性可分為球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[10]。谷蛋白是稻米中重要的貯藏蛋白[11-12]，其含量占種子總蛋白的80%左右[13]，它是稻米中僅次于淀粉易于被人體消化吸收的主要胚乳成分[14]。醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白的占比則分別為1%～5%、2%～10%、2%～5%[15-17]。我國(guó)稻米產(chǎn)量居世界第一，但由于稻米品質(zhì)以及品質(zhì)檢測(cè)技術(shù)落后等原因，我國(guó)的稻米在國(guó)際市場(chǎng)上缺乏競(jìng)爭(zhēng)力[18-19]。關(guān)于蛋白質(zhì)與稻米品質(zhì)之間的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道[20]，但主要集中在表觀蛋白質(zhì)含量與食味品質(zhì)之間的關(guān)系變化上。如有研究表明，稻米的蛋白質(zhì)含量越低，則其食味評(píng)分越高[21]。WAKAMATSU 等[22-23]通過(guò)設(shè)置不同的氮肥處理以增加籽粒蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明，食味較好的稻米蛋白質(zhì)含量在6%～7%，大于7%則食味會(huì)降低。稻米食味值與谷蛋白的含量呈不顯著的負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著谷蛋白含量的增加，稻米的食味品質(zhì)有下降趨勢(shì)[24]。清蛋白是與稻米食味品質(zhì)優(yōu)劣關(guān)系更密切的蛋白，目前對(duì)稻米清蛋白的研究甚少。馬建[25]研究了幾種電泳技術(shù)在水稻品種鑒定上的應(yīng)用，并未與食味建立相關(guān)關(guān)系。大多數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)與食味品質(zhì)的研究主要關(guān)注點(diǎn)是氮素方面[26]。目前，水稻蛋白電泳技術(shù)僅應(yīng)用于品種鑒定方面，在稻米食味品質(zhì)研究中的應(yīng)用較少。且對(duì)蛋白質(zhì)含量與水稻食味品質(zhì)的關(guān)系研究?jī)H停留在表觀蛋白質(zhì)含量上。因此將水稻蛋白質(zhì)電泳技術(shù)應(yīng)用于食味品質(zhì)評(píng)價(jià)中，有助于水稻品質(zhì)改良的研究，為提高稻米品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。本文在前人研究基礎(chǔ)上，改進(jìn)并優(yōu)化了水稻谷蛋白和清蛋白電泳方法，并應(yīng)用于稻米食味品質(zhì)研究中，從蛋白質(zhì)組分分析稻米食味品質(zhì)，為優(yōu)質(zhì)水稻早期世代材料篩選及品質(zhì)改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 水稻品種來(lái)源

以粗蛋白質(zhì)含量接近、食味評(píng)分不同的水稻品種龍粳香1 號(hào)、長(zhǎng)粒香2 號(hào)、墾粳12、龍粳29、五優(yōu)稻、高粱稻為試驗(yàn)材料，具體見(jiàn)表1。其中，長(zhǎng)粒香2 號(hào)分別來(lái)源于同江市和富錦市。

表1 不同來(lái)源水稻品種蛋白質(zhì)含量及食味評(píng)分

圖1 不同谷蛋白提取方法電泳圖譜比較

1.1.2 化學(xué)試劑

所有試劑都是國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純，用蒸餾水配制有關(guān)溶液，電泳儀和電泳槽型號(hào)為BIO-RAD Power Pac，產(chǎn)地新加坡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大米粉制備

稻米經(jīng)自然風(fēng)干后，稱取100 g，先用糙米機(jī)碾成糙米，再將糙米通過(guò)精米機(jī)碾成精米。精米經(jīng)磨粉機(jī)碾磨成粉，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水稻蛋白提取

谷蛋白：參考馬健[25]的方法并進(jìn)行了優(yōu)化。稱取40 g 大米粉于燒杯中，加入40 mL 蒸餾水浸泡。攪拌至混勻，靜置1 h，手動(dòng)攪拌15 min，4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清。沉淀加入40 mL 0.03 mol/L NaoH（aq），手動(dòng)攪拌18 min，4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清，調(diào)pH 值至4.8，再用4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min。收集沉淀，水洗3 次，得到的谷蛋白自然陰干，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

清蛋白：參考楊靜等[24]的方法并進(jìn)行了優(yōu)化。提取清蛋白的溶劑為蒸餾水。大米粉與蒸餾水比為1∶1，搖床振蕩提取2 h。15000r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清于2 mL 離心管內(nèi)，于-20°C 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 凝膠配制

1.2.2.1 分離膠的配制 （1）27.23 g Trizma base 溶解于80 mL 的蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH 值至8.8，蒸餾水定容至150 mL。（2）量取步驟1 中的溶液25 mL，加入40 mL 的30% Monomer Sol'n、1 mL 10%SDS、33.5 mL的蒸餾水混勻，4°C 保存?zhèn)溆?。?）量取步驟2 中的溶液9.95 mL，加入50 uL 10% 過(guò)硫酸銨，5 uL 的TEMED，混勻，灌入膠板中。上層加入蒸餾水封口。等待分離膠凝固。

1.2.2.2 濃縮膠的配制 （1）6.0 g Trizma base 溶解于60 mL 的蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH 值至6.8，蒸餾水定容至100 mL。（2）量取步驟1 中的溶液25 mL，加入13 mL 的30% Monomer Sol’n，0.5 mL 10%SDS，61 mL 的蒸餾水混勻，4℃保存?zhèn)溆?。?）量取步驟2 中的溶液10 mL，加入50 uL 10% 過(guò)硫酸銨、10 uL 的TEMED 混勻。待分離膠凝固，倒出表面的水層，將配制好的濃縮膠灌入膠板中。然后插入梳子，等待凝固。

1.2.4 電泳

蛋白提取液的配制：0.125 mol/L Tris-Hcl（pH 值6.8）、4% SDS、20%甘油、4 mol/L 脲素、5% 巰基乙醇。

谷蛋白進(jìn)樣量為7 μL，清蛋白進(jìn)樣量為10 μL。電泳開(kāi)始時(shí)，恒定電壓為100V ，當(dāng)樣品到達(dá)分離膠時(shí)，電壓降至80V，電泳2.5 h。

1.2.5 蛋白固定

電泳結(jié)束，取出凝膠。將凝膠浸入40 mL 的10%三氯乙酸中，搖床振蕩固定蛋白。過(guò)夜固定。

1.2.6 染色與脫色

凝膠置于40 mL 考馬斯亮藍(lán)R-250 溶液中，搖床染色2 h。然后在冰乙酸、甲醇、水混合溶液（三者比為10∶45∶45）中脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻谷蛋白電泳

2.1.1 水稻谷蛋白提取方法的優(yōu)化

圖1A 是采用文獻(xiàn)中堿提酸沉的方法提取的水稻谷蛋白，即將大米粉以一定的固液比直接浸泡于堿液中，然后進(jìn)行酸沉。得到的圖譜效果很差，譜帶模糊。圖1B 圖則是進(jìn)行改進(jìn)后的谷蛋白圖譜，先用水浸泡大米粉，再加入堿液，酸沉得到谷蛋白。此方法得到的谷蛋白進(jìn)行電泳圖譜清晰度明顯優(yōu)于圖1A。但是優(yōu)化后的圖譜也存在一定問(wèn)題，如雜帶太多、清晰度稍差等。

因水溶性蛋白干擾，需對(duì)谷蛋白的提取方法再次優(yōu)化。采用先水浸提，通過(guò)離心的方式去掉大部分水分，加入堿液，同時(shí)降低了堿液的濃度。再經(jīng)過(guò)酸沉、水洗得到谷蛋白，進(jìn)行電泳試驗(yàn)，得到的圖譜如圖1 C。該圖譜譜帶分明，清晰度也很好。

2.2.2 水稻谷蛋白電泳上樣量的優(yōu)化

圖2 不同谷蛋白進(jìn)樣量電泳圖譜比較

圖3 北方粳稻與南方粳稻谷蛋白電泳圖譜比較

圖4 蛋白質(zhì)含量相近水稻谷蛋白電泳圖譜比較

圖2 中左邊的圖采用的進(jìn)樣量為10 uL，發(fā)現(xiàn)譜帶不清晰。對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行了優(yōu)化，從5～9 uL 之間進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，7 uL 是最適宜的上樣量。

2.2.3 水稻谷蛋白電泳應(yīng)用

2.2.3.1 北方大米與南方大米樣品谷蛋白電泳差異分析 由圖3 看出，3 個(gè)東北大米之間譜帶無(wú)差異，4 個(gè)來(lái)源于江蘇的大米樣品之間譜帶也無(wú)差異。但東北大米和江蘇大米的圖譜出現(xiàn)了差異，B3565（南粳9108）在60 kDa 處譜帶缺失。可見(jiàn)，水稻谷蛋白電泳能夠鑒定南方水稻與北方水稻谷蛋白亞基結(jié)構(gòu)差異。

2.2.3.2 蛋白質(zhì)含量相近的大米樣品谷蛋白電泳差異分析 選取蛋白質(zhì)含量接近、食味評(píng)分相差較大的大米樣品進(jìn)行谷蛋白電泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)樣品蛋白質(zhì)含量變異幅度為7.70%～7.91%，食味評(píng)分變異幅度為71～90 分。由圖4 可知，7 個(gè)樣品的譜帶并沒(méi)有明顯的差異。

圖5 蛋白質(zhì)含量相近的水稻清蛋白電泳圖譜比較

2.3 水稻清蛋白電泳

2.3.1 蛋白質(zhì)含量相近的大米樣品清蛋白電泳差異分析

對(duì)蛋白質(zhì)含量接近、食味評(píng)分相差較大的7 個(gè)樣品進(jìn)行清蛋白電泳圖譜分析。從圖5 可以看出，龍粳香1 號(hào)水稻樣品譜帶與其他樣品譜帶不同，在70～105 kDa 處出現(xiàn)了譜帶的缺失。在105 kDa 處，長(zhǎng)粒香2 號(hào)條帶也出現(xiàn)了譜帶的缺失。由表1 看出，這2 個(gè)樣品的食味評(píng)分很低。譜帶顏色較深的高粱稻，其食味評(píng)分最高。龍粳29 和五優(yōu)稻的譜帶顏色次之，其食味評(píng)分也對(duì)應(yīng)下降。

3 討論與結(jié)論

按照現(xiàn)有谷蛋白電泳方法進(jìn)行水稻谷蛋白電泳，發(fā)現(xiàn)水稻樣品譜帶重疊無(wú)法區(qū)分，通過(guò)查閱大量資料，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，筆者在蛋白質(zhì)提取方法、化學(xué)試劑用量等方面進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種新的谷蛋白電泳方法。采用新的谷蛋白電泳方法對(duì)蛋白質(zhì)含量相近、食味值有差異的水稻樣品進(jìn)行譜帶分析，發(fā)現(xiàn)品種之間譜帶無(wú)差異；對(duì)北方粳稻與南方粳稻品種進(jìn)行谷蛋白電泳譜帶分析，發(fā)現(xiàn)北方粳稻與南方粳稻品種譜帶有差異，而北方粳稻品種之間或南方粳稻品種之間譜帶差異不大。

目前，有關(guān)水稻清蛋白電泳方法研究較少，利用該方法對(duì)水稻食味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?，F(xiàn)有研究表明，水稻表觀蛋白質(zhì)含量越低，米飯食味值越高。本研究對(duì)表觀蛋白質(zhì)含量相近、食味值差異較大的水稻品種進(jìn)行清蛋白電泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)105 kDa 處譜帶缺失，其米飯食味值較低；105 kDa 處譜帶顏色越深，其米飯食味值越高。105 kDa 為水稻食味優(yōu)質(zhì)亞基。本研究為初步結(jié)果，下一步需通過(guò)液相色譜法定量檢測(cè)做進(jìn)一步驗(yàn)證工作。