吳維棟 黃 麟 吳煒焊 朱 勇

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，福建福州 350001

真核生物的細(xì)胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍存在的長約20～25kb的一類內(nèi)源性的非編碼RNA，我們稱之為微RNA（microRNA，miRNA），并且微RNA對其生物具有一定的調(diào)節(jié)控制作用，基本上有較多的miRNA基因都存在于基因組的基因間隔區(qū)、外顯子區(qū)或者基因的內(nèi)含子之間。經(jīng)過成熟的單鏈miRNA分子和靶mRNA序列相互組合，對mRNA進(jìn)行調(diào)節(jié)。并且以后發(fā)展過程中針對OB得的研究方法，主要是從基因組學(xué)入手，下面我們將會起到更多作用的TRPC1蛋白和指定的miRNA相互結(jié)合，進(jìn)行分析研究，得出一定結(jié)論。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

購買華中科技大學(xué)動物中心的清潔級SD大鼠24只，圴為雄性，重量250～350g，隨機(jī)分為模型組、對照組。SPF級近交系Brown Norway（BN）大鼠6只和Lewis大鼠18只，供體為BN大鼠，受體為Lewis大鼠；對照組中的供體和受體都采用的是Lewis大鼠。

1.2 方法

分別選用SPF級近交系Brown Norway（BN）大鼠6只和Lewis大鼠18只建立肺移植動物模型。模型建立分為兩組，模型組的供體為BN大鼠，受體為Lewis大鼠，而對照組中供體和受體都使用的是Lewis大鼠，首先將作為供體的BN大鼠腹腔部位用10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，H37022673）4mL/kg進(jìn)行麻醉，頸胸部位經(jīng)過消毒后，中間部位劃出小口看到氣管，再將整段氣管取出來，并去掉氣管外的隔膜組織，修整好氣管兩段，供體則使用5環(huán)1段，用4℃生理鹽水沖洗干凈之后浸泡留用[2]。然后對作為受體的Lewis大鼠使用同樣方法讓氣管暴露在外，在不傷害喉部神經(jīng)的情況下，以環(huán)狀軟骨下第4、5環(huán)間為中心上下對兩環(huán)氣管分開，完全分離后對氣管取出，在第4、5環(huán)之間劃開氣管，膜部保留1/5的完整。對氣管內(nèi)存在的分泌物經(jīng)過清理后植入供體氣管。植入過程中注意尾側(cè)重合，膜部對膜部，軟骨部對軟骨部，用7-0尼龍線在正上方先縫合一針固定，之后在左右兩側(cè)中間再進(jìn)行一針縫合，最后一針則對正下方位置進(jìn)行縫合，要先將膜部縫合好之后才能對頭側(cè)進(jìn)行合成，最后一針在中間上方進(jìn)行縫合從而完成氣管移植。手術(shù)2個月后OB模型建組建成功[3]。

通過在模型組和對照組各取6例大鼠，篩選出大鼠移植氣管組織在miRNA方面的的差異，具體方法為：對手術(shù)將個月后組建模型成功的大鼠進(jìn)行研究，將移植的氣管完整取出，并分為相同的三段，一段用于進(jìn)行病理學(xué)試驗，提取另一段提取完整RNA，最后放置一段用于之后的研究討論，最后通過送往上海具有先進(jìn)技術(shù)的基因化學(xué)技術(shù)單位對miRNA基因芯片進(jìn)行檢測，對兩組大鼠miRNA表達(dá)差異進(jìn)行對比。通過RT-qPCR方法對miRNA進(jìn)行驗證。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）檢測移植氣管組織病理反應(yīng)。（2）討論miRNA芯片的治療成效。（3）使用RT-qPCR驗證芯片得到結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植氣管組織病理學(xué)檢測成果

對1個月后因閉塞性細(xì)支氣管炎組建成功的移植氣管，和同時間內(nèi)對照組移植的大鼠氣管進(jìn)行實驗對比，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠氣管傷口均恢復(fù)較好，氣管周圍頸部肌肉也逐漸長出，軟骨特征明顯，未出現(xiàn)其他問題，另外移植的氣管病理狀況經(jīng)過蘇木精-伊紅染色檢查，模型組的移植氣管恢復(fù)情況較好，未出現(xiàn)明顯的病變反應(yīng)，或僅僅是出現(xiàn)輕微的炎癥；而因模型組閉塞性細(xì)支氣管炎的移植氣管，其氣管壁出現(xiàn)不同程度病理反應(yīng)，主要是內(nèi)部上皮發(fā)生異常或者出現(xiàn)黏膜腺體消失的狀況。見圖1。

圖1 大鼠移植氣管的病理變化圖

2.2 miRNA芯片研究檢測結(jié)論

通過使用600個miRNA芯片對模型組的移植氣管和對照組miRNA表達(dá)差異進(jìn)行分析研究，經(jīng)過對比分析檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA較為顯著的有70個，模型組的移植氣管和對照組差異表達(dá)值控制在0.6～2.1的有40個，總差異表達(dá)miRNA的占比為57.15%，其檢測結(jié)果無明顯差異。差異表達(dá)miRNA明顯的有30個，總差異表達(dá)miRNA的占比為42.85%，中間有16個差異表達(dá)明顯下調(diào)，差異表達(dá)明顯miRNA的占比為53.33%；表達(dá)明顯上調(diào)的有14個，差異表達(dá)明顯miRNA的占比為46.67%。

2.3 芯片采用RT-qPCR驗證得出結(jié)論

對同等數(shù)量的表達(dá)明顯上升的miR-146a、miR-155和表達(dá)明顯降低的miR-451，以miRNA微陣列芯片檢驗的最終結(jié)論為基礎(chǔ)進(jìn)行檢測，從而使得RT-qPCR驗證得出的結(jié)果更為精確，經(jīng)過分析研究發(fā)現(xiàn)模型組miR-146a和miR-155基因與對照組的表達(dá)量結(jié)果無明顯區(qū)別；模型組miR-451基因表達(dá)量明顯高于對照組，其對比結(jié)果有明顯差異，對之后研究的準(zhǔn)確性提供了理論依據(jù)。

利用預(yù)測miRNA靶基因常用的TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測兩組差異表達(dá)顯著的miRNA靶基因。作為本研究模型組miRNA靶基因的代表，其中miR-146a靶基因是IRAK1和TRAF6，前者與白細(xì)胞介素1引起的核因子KB上調(diào)有關(guān)，后者參與炎癥細(xì)胞反應(yīng)；miR-155靶基因為TSHZ3，其參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；而miR-451的靶基因則是Tollip，與炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)。

3 討論

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過肺移植后出現(xiàn)死亡主要是因為出現(xiàn)閉塞性細(xì)支氣管炎（obliterative bronchiolitis，OB），發(fā)生的原因是因為小氣道周圍炎性淋巴細(xì)胞浸潤，造成出現(xiàn)的纖維增生和瘢痕阻塞細(xì)支氣管，導(dǎo)致肺功能出現(xiàn)病變。大約有一半的OB都是出現(xiàn)在肺移植五年后，10年出現(xiàn)OB的概率高達(dá)80%。嚴(yán)重的發(fā)生OB五年后死亡率高達(dá)60%。所以要保證肺移植遠(yuǎn)期的治療效果更穩(wěn)定，需要有效的控制患者出現(xiàn)OB。目前研究表明OB主要通過纖維化、淋巴細(xì)胞及抗體介導(dǎo)途徑等機(jī)制致病，至OB的終末階段，呼吸道上皮的損傷使炎癥細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞脫落、基底祖細(xì)胞銳減，其中可能發(fā)生小氣道上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial tomesenchymal transition，EMT），使纖維母細(xì)胞過度累積和纖維增生[6]。以單一的全方位存在細(xì)胞膜上的陽離子通道作為經(jīng)典瞬時受體電位通道（transient receptor potential channel，TRPC），哺乳動物TRPC又被分為TRPC1～7七個亞型參與各種細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流，調(diào)節(jié)Ca2+濃度從而影響細(xì)胞的功能[7]。哺乳動物TRP通道一開始指的就是TRPC1，我們認(rèn)為其作用主要是將細(xì)胞膜受體激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）中的鈣離子進(jìn)入，參與鈣依賴的平滑肌及腺體的分泌和收縮功能[8]。微RNA（microRNA，miRNA）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其長約20～25kb，主要存在于細(xì)胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近[9]。基因組的基因間隔區(qū)或者基因的內(nèi)含子中含有大量的miRNA基因。通過將完整的的單鏈miRNA分子與靶mRNA序列互補配對，調(diào)節(jié)mRNA的翻譯。

有部分學(xué)者認(rèn)為主要是因為免疫系統(tǒng)出現(xiàn)排斥反應(yīng)，才造成出現(xiàn)肺移植閉塞性細(xì)支氣管炎[10]，還有就是其他非免疫因素也會出現(xiàn)這種情況，為降低肺移植排斥問題一直著重于分析研究怎樣做好適應(yīng)性免疫，根據(jù)眾多的實驗檢測證明，出現(xiàn)閉塞性細(xì)支氣管炎的主要原因是體液免疫、自體免疫、固有免疫等這些方面出現(xiàn)問題，并且出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的主要位置是氣道上皮（airwaye Pithehalcen，AEC），miRNA對眾多的重要生命過程都有著很大影響[11]。經(jīng)過檢測證明，miRN作為免疫調(diào)控因子，包括了對固有性免疫應(yīng)答與炎性反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，較為明顯的是，要想做好免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，離不開miRNA的重要調(diào)節(jié)控制[12]。要進(jìn)一步認(rèn)識了解移植后閉塞性細(xì)支氣管炎發(fā)病原因，需要通過分析檢查出miRNA的差異性表達(dá)和功能機(jī)制。當(dāng)下我們使用最頻繁的篩查miRNA差異表達(dá)的方法是miRNA全基因譜芯片法，這種方法在使用過程中存在一定的局限性，因此需要進(jìn)一步利用RT-qPCR等方法進(jìn)行檢測，進(jìn)而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]。

現(xiàn)在在關(guān)于miRNA的作用和質(zhì)量方面僅僅是發(fā)現(xiàn)了一小部分，還有更大的空間供我們?nèi)パ芯刻剿?，不斷的發(fā)現(xiàn)miRNA可以讓我們更好對不同的生理病理機(jī)制進(jìn)行分析，同時可以采用新的治療方法和理論依據(jù)對疾病進(jìn)行診治。經(jīng)過研究證明，miRNA表達(dá)經(jīng)過精準(zhǔn)控制可以調(diào)節(jié)出一種節(jié)能而又有效的調(diào)節(jié)通路。在不斷的發(fā)現(xiàn)miRNA作用的過程中，分析出轉(zhuǎn)錄因子和剪接因子這兩種基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子與miRNA之間可以進(jìn)行直接或間接的相互調(diào)節(jié)控制?，F(xiàn)在是主要在miRNA功能中發(fā)現(xiàn)探索并分析確定miRNA直接作用的靶基因同時了解其調(diào)控機(jī)制。miRNA在轉(zhuǎn)錄后是以水平調(diào)節(jié)基因的小分子RNA形式表達(dá)出來的，通過轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，將共同作用的靶基因在出現(xiàn)免疫和炎癥反應(yīng)下進(jìn)行調(diào)節(jié)，在免疫系統(tǒng)中有著重要的作用。經(jīng)研究證實，通過使用miR-451對癌基因C-myc及細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，可以阻止細(xì)胞周期的發(fā)展，也避免細(xì)胞過快的增加繁殖。

經(jīng)過全面分析討論，微小RNA可以更好的調(diào)節(jié)控制在肺移植后出現(xiàn)閉塞性細(xì)支氣管炎的病情發(fā)展?fàn)顩r。