王蕾 孫豪 計(jì)婧 趙暉 薛冰 金良韻 齊放 李君玲 樊永平

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種自身免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)慢性炎性脫髓鞘疾病。MS臨床表現(xiàn)復(fù)雜，常見(jiàn)有肢體無(wú)力、肢體麻木疼痛、視力下降、大小便異常等癥狀，甚則癱瘓、失明或死亡。85%～90%的患者表現(xiàn)為復(fù)發(fā)緩解型MS，其高復(fù)發(fā)率和高致殘率嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康生命[1-2]。MS以炎癥、脫髓鞘和軸突損傷為主要病理特征。MS的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但與自身免疫反應(yīng)有關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS固有的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)鈣離子結(jié)合蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1，Iba-1)和CD68，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ)信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化[3]。在MS的病理過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，炎性反應(yīng)占主導(dǎo)，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增多，在發(fā)揮吞噬作用的同時(shí)也釋放大量促炎因子，如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等，加劇炎癥反應(yīng)，使大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)組織，導(dǎo)致神經(jīng)損傷，最終演變成神經(jīng)退行性病變[4]。前期研究證實(shí)，補(bǔ)腎益髓(BushenYisui，BSYS)膠囊能明顯降低MS復(fù)發(fā)率，改善其臨床癥狀和生存率等[5-6]，重建CNS免疫穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[7-8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，本方可明顯對(duì)MS模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[9-10]，但其分子調(diào)控機(jī)制尚未明確。故本實(shí)驗(yàn)利用EAE小鼠模型，從小膠質(zhì)細(xì)胞角度，深入探討B(tài)SYS對(duì)EAE小鼠的神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重15～17 g， 80只，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(軍)2012-0004，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，合格證號(hào)為SYXK(京)2015-0012。實(shí)驗(yàn)室溫度18～22℃，相對(duì)濕度30%～50%，每12小時(shí)進(jìn)行晝夜交替光照，自由飲食和飲水，每日更換干凈墊料。所有實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物福利委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

醋酸潑尼松片(prednisone acetate，PA)由天津力生制藥有限公司生產(chǎn)。補(bǔ)腎益髓膠囊由北京亞?wèn)|生物制藥有限公司制備，其藥物組成和劑量為生地黃208 g、熟地黃208 g、制何首烏208 g、浙貝母125 g、益母草208 g、水蛭69 g、全蝎42 g、酒大黃42 g、天麻69 g、連翹125 g，以上十味，浙貝母研細(xì)粉，其余九味加水煎煮兩次，合并煎液，藥液過(guò)濾后減壓濃縮成稠膏，加入浙貝母細(xì)粉混勻，裝入膠囊，制成1000粒備用。

1.3 對(duì)照組大鼠卵巢組織存在少

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendroglia glycoprotein，MOG)35-55由北京旭和源生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)，批號(hào)：SLBH7316V，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；滅活結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB，H37Ra)，批號(hào)：4283842，購(gòu)自美國(guó)BD公司；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)，批號(hào)：SLBP1591V，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Iba-1(貨號(hào)：ab15690)和CD68(貨號(hào)：ab31630)均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；IL-1β和IL-4試劑盒(貨號(hào)：AE900731Mu、AE900245Mu)均購(gòu)自浙江AMEKO公司。PCR引物由江蘇愛(ài)必夢(mèng)生物技有限公司合成；RNA檢測(cè)相關(guān)試劑購(gòu)于北京天根生化科技有限公司等。

1.4 EAE小鼠模型制備

用生理鹽水將MOG35-55稀釋為250 μg/mL，與等量 CFA乳液混合，將MTB加入到混合液中，將MTB的濃度調(diào)至2 mg/mL，并將上述液體放入注射器內(nèi)反復(fù)抽推成油包水乳劑，在造模當(dāng)天和第7天給予小鼠背部皮下四點(diǎn)注射0.2 ml抗原乳劑。造模當(dāng)天及48小時(shí)內(nèi)腹腔注射PTX 500 ng，建立EAE小鼠模型，從體重下降、神經(jīng)評(píng)分和脫髓鞘等病理變化作為模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 分組及給藥

將造模成功的80只小鼠隨機(jī)分為4組，分別是正常組、模型組、醋酸潑尼松組及補(bǔ)腎益髓膠囊組，每組20只。正常組小鼠以等量生理鹽水代替。造模后開(kāi)始進(jìn)行小鼠灌胃給藥，補(bǔ)腎益髓膠囊組給予劑量為3.02 g生藥/(kg體重)，模型組和醋酸潑尼松組均灌服等量蒸餾水，待小鼠發(fā)病后，醋酸潑尼松組開(kāi)始給予5 mg/(kg體重)灌胃。每天1次，連續(xù)40天。

1.6 樣本處理和檢測(cè)指標(biāo)

分別于第23天(急性期)和第40天(緩解期)取小鼠腦和脊髓。其中，每期隨機(jī)選取2～3只小鼠用2%多聚甲醛和2%戊二醛灌注，取小鼠腦及脊髓1 mm3小塊，2%戊二醛固定2小時(shí)，于0.1 mol 磷酸緩沖液中4℃儲(chǔ)存，用于透射電鏡觀察；另取3只小鼠用多聚甲醛灌注固定，取小鼠腦及脊髓，石蠟包埋切片，用于IHC檢測(cè)；再取4只小鼠給予2%異氟烷吸入麻醉，取小鼠大腦及脊髓用于ELISA和qRT-PCR等檢測(cè)。

1.6.1 小鼠體重和疾病負(fù)荷的觀察 每天對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重和神經(jīng)評(píng)分觀察。采用15分評(píng)分法[11]評(píng)估小鼠尾巴和四肢的狀態(tài)。尾巴分3個(gè)等級(jí)： 0分為正常，1分表示尾巴半癱瘓，2分表示尾巴完全癱瘓；四肢分四個(gè)等級(jí)(前肢或后肢要單獨(dú)評(píng)估)：0為正常，1分表示步態(tài)不穩(wěn)，2分表示輕癱，3分表示完全癱瘓。通過(guò)累計(jì)分?jǐn)?shù)得出評(píng)分，死亡等于15分。再將小鼠每天的神經(jīng)評(píng)分累加，即為疾病負(fù)荷，反映小鼠總體發(fā)病情況。

1.6.2 透射電鏡觀察小鼠神經(jīng)髓鞘超微結(jié)構(gòu)的變化 取小鼠腦和脊髓小塊，清洗后，1%鋨酸固定2小時(shí)，乙醇梯度脫水，包埋劑包埋樣品，45℃下聚合24小時(shí)，70℃下聚合48小時(shí)，超薄切片，鉛鈾染色。透射電鏡觀察。隨機(jī)選擇多個(gè)視野觀察，采用圖像分析軟件對(duì)小鼠腦和脊髓髓鞘和軸突直徑進(jìn)行半定量分析，計(jì)算髓鞘與軸突直徑比值G-ratio[12]，以評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷程度。

1.6.3 IHC法檢測(cè)小鼠腦和脊髓Iba-1和CD68蛋白表達(dá) 小鼠腦和脊髓切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，檸檬酸修復(fù)抗原后，用3%H2O2室溫孵育后血清封閉。去封閉液后，滴加一抗液Iba-1(1∶200)和CD68(1∶200)，4℃孵育12小時(shí)。37℃復(fù)溫1小時(shí)，依次加入二抗試劑，置于37℃孵育，滴加DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取多個(gè)不同的視野，測(cè)定Iba-1和CD68積分光密度(integral optical density，IOD)。

1.6.4 ELISA法測(cè)定小鼠腦和脊髓IL-1β和IL-4細(xì)胞因子的表達(dá) 按照小鼠IL-1β和IL-4試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的濃度，所有數(shù)據(jù)除以正常值的比值表示。

1.6.5 qRT-PCR法檢測(cè)小鼠腦及脊髓中PPAR-γ mRNA表達(dá) 取小鼠腦或脊髓30～40 mg，采用Trizol法提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定260/280比值和RNA濃度。PCR引物采用Gene Bank Accession公布的序列，通過(guò)primier 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)，由中國(guó)江蘇愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司合成，引物及反應(yīng)體系見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件如下：變性1，90℃，30秒；退火溫度58℃，20分鐘；變性2，95℃，30秒；PCR 循環(huán)，95℃，5秒；45～48循環(huán)分別為50℃，10秒，以及74℃，15秒，收集數(shù)據(jù)，分析qRT-PCR的溶解曲線、擴(kuò)增曲線，以基因GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，采用△△Ct方法分析基因的表達(dá)量。

表1 引物反應(yīng)序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠發(fā)病率、死亡率及潛伏期的影響

模型組與醋酸潑尼松組發(fā)病率均為90%，補(bǔ)腎益髓膠囊組為85%；造模各組死亡率均為5%；模型組小鼠潛伏期最短，為(13.7±1.1)天；醋酸潑尼松組及補(bǔ)腎益髓膠囊組潛伏期有不同程度的延長(zhǎng)，分別為(13.9±1.0)天和(14.8±1.5)天，其中，補(bǔ)腎益髓膠囊組與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組EAE小鼠發(fā)病率、死亡率及潛伏期變化比較

注： 與模型組相比，aP<0.05。

2.2 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠體重的影響

造模前各組小鼠體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。正常組體重始終呈上升趨勢(shì)，造模后模型組體重緩慢上升，從第15天后體重開(kāi)始明顯下降(P<0.05，P<0.01)。醋酸潑尼松組及補(bǔ)腎益髓膠囊組造模后體重緩慢上升，于發(fā)病前第9～12天稍有下降，但從第13天起，體重呈緩慢上升，與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠疾病負(fù)荷的影響

采用15分評(píng)分法進(jìn)行小鼠神經(jīng)評(píng)分觀察，將小鼠神經(jīng)評(píng)分累加即為疾病負(fù)荷。與模型組比較，醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組小鼠的疾病負(fù)荷顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠神經(jīng)髓鞘損傷的影響

透射電鏡所示，正常組小鼠腦和脊髓的神經(jīng)髓鞘板層結(jié)構(gòu)完整致密；模型組髓鞘板層結(jié)構(gòu)松散、分離、密度下降，甚至髓鞘缺失，軸突萎縮，間隙變大且出現(xiàn)空泡；醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組的上述病理變化均有不同程度的改善(圖3～4)。G-ratio是髓鞘中內(nèi)徑與外徑的比值，可以反映髓鞘損傷與脫失程度。在造模后第23天和40天時(shí)，模型組小鼠腦及脊髓G-ratio比值較正常組明顯上升(P<0.01)，而醋酸潑尼松組與補(bǔ)腎益髓膠囊組小鼠G-ratio比值較模型組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05。

圖1各組EAE小鼠體重的變化

注：與模型組相比，aP<0.05。

圖2各組EAE小鼠疾病負(fù)荷的變化

注：A 正常組；B 模型組；C 醋酸潑尼松組；D 補(bǔ)腎益髓膠囊組。

圖3各組EAE小鼠腦的髓鞘超微結(jié)構(gòu)變化(透射電鏡×20,000)

注：A 正常組；B 模型組；C 醋酸潑尼松組；D 補(bǔ)腎益髓膠囊組。

圖4各組EAE小鼠脊髓的髓鞘超微結(jié)構(gòu)變化(透射電鏡×20,000)

2.5 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠腦及脊髓Iba-1表達(dá)的影響

Iba-1為鈣離子結(jié)合蛋白，是MG的標(biāo)志性蛋白，為觀察EAE小鼠MG數(shù)量變化，采用IHC法檢測(cè)了各組小鼠Iba-1蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，造模后第23天和40天，與正常組相比，模型組小鼠腦及脊髓Iba-1表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組Iba-1表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表4，圖5～6。

表3 各組EAE小鼠腦及脊髓髓鞘G-ratio的變化比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01。

表4 各組EAE小鼠腦及脊髓Iba-1蛋白的表達(dá)比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

注：A 正常組；B 模型組；C 醋酸潑尼松組；D 補(bǔ)腎益髓膠囊組。

圖5各組EAE小鼠腦Iba-1蛋白的表達(dá)(IHC×400)

注：A 正常組；B 模型組；C 醋酸潑尼松組；D 補(bǔ)腎益髓膠囊組。

圖6各組EAE小鼠脊髓Iba-1蛋白的表達(dá)(IHC×400)

2.5 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠腦及脊髓CD68表達(dá)的影響

研究顯示，在炎癥免疫反應(yīng)中，CD68陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多與小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)，因此，使用IHC法檢測(cè)了各組小鼠CD68蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，造模后第23天和40天，與正常組比較，模型組腦及脊髓中CD68表達(dá)顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組CD68表達(dá)明顯下降(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表5，圖7～8。

2.6 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠腦IL-1β和IL-4表達(dá)的影響

結(jié)果表明，造模后第23天和第40天，與正常組比較，模型組腦IL-1β明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而IL-4顯著下降(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比，醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組IL-1β明顯下降(P<0.01)，而醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組IL-4顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表6。

表5 各組EAE小鼠腦及脊髓CD68蛋白的表達(dá)比較

注： 與正常組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，dP<0.01。

注：正常組；B 模型組；C 醋酸潑尼松組；D 補(bǔ)腎益髓膠囊組。

圖7各組EAE小鼠腦CD68蛋白的表達(dá)(IHC×400)

注：A 正常組；B 模型組；C 醋酸潑尼松組；D 補(bǔ)腎益髓膠囊組。

圖8各組EAE小鼠脊髓CD68蛋白的表達(dá)(IHC×400)

表6 各組EAE小鼠腦IL-1β及IL-4的變化

注： 與正常相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，dP<0.01。

表7 各組EAE小鼠腦及脊髓PPAR-γ mRNA表達(dá)的變化

注： 與正常組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05。

2.7 補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)EAE小鼠腦及脊髓PPAR-γ mRNA表達(dá)的影響

采用qRT-PCR法檢測(cè)了小鼠腦及脊髓PPAR-γ mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，在第23天和第40天時(shí)，與正常組比，模型組小鼠腦及脊髓PPAR-γ mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比，醋酸潑尼松組和補(bǔ)腎益髓膠囊組小鼠腦中PPAR-γ mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，第40天時(shí)醋酸潑尼松組小鼠脊髓PPAR-γ mRNA升高明顯(P<0.05)，而第23天時(shí)補(bǔ)腎益髓膠囊組小鼠脊髓PPAR-γ mRNA升高顯著(P<0.05)。見(jiàn)表7。

3 討論

本課題組基于長(zhǎng)期對(duì)MS的臨床研究，認(rèn)為MS與“痿證”的“骨痿”最為接近[13]，腎主骨生髓，因此本病與腎的關(guān)系最為密切，《素問(wèn)·痿論篇》有云：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。” MS的病機(jī)是五臟失衡，核心在腎，腎虛髓虧是本。在分析文獻(xiàn)報(bào)道的851例MS患者和收集的500例MS患者證候特點(diǎn)的基礎(chǔ)上[14-15]，總結(jié)出本病的基本病機(jī)是肝腎陰虛兼痰瘀阻絡(luò)，腎虛髓虧，神經(jīng)髓鞘脫失，加之痰瘀阻滯，神經(jīng)髓鞘修復(fù)困難，故治宜滋補(bǔ)肝腎，化痰活血通絡(luò)，方為補(bǔ)腎益髓方。本方以生地黃、熟地黃等滋陰補(bǔ)腎，填精益髓，輔以浙貝母等清熱化痰，益母草、水蛭、全蝎等活血通絡(luò)，補(bǔ)腎可使腦髓得充，氣血通利，以增強(qiáng)化痰活血之功，正如《景岳全書(shū)》曰“峻補(bǔ)真陰，使血?dú)饬骼?；化痰活血可祛除痰瘀之邪，有利于補(bǔ)腎作用的發(fā)揮，諸藥相合，標(biāo)本同治，攻補(bǔ)兼施，共行補(bǔ)腎化痰活血之功。本方制成膠囊制劑，獲北京市藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)(臨10003)。在臨床研究中運(yùn)用本方治療MS患者取得了顯著療效。本課題組對(duì)補(bǔ)腎益髓膠囊治療60例MS患者進(jìn)行了隨機(jī)、對(duì)照、盲法試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本方顯著降低中醫(yī)癥狀評(píng)分、傷殘等級(jí)評(píng)分、MS影響量表和修訂疲勞影響量表評(píng)分，優(yōu)于單獨(dú)西藥組；磁共振波譜及彌散張量成像發(fā)現(xiàn)本藥能促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)，明顯改善了患者的生存質(zhì)量[6]。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證明本藥對(duì)EAE小鼠也有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用和促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)[7-10]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，補(bǔ)腎益髓膠囊能夠延長(zhǎng)EAE小鼠的潛伏期，提高小鼠降低的的體重，并減輕了疾病負(fù)荷，減少了髓鞘脫失和神經(jīng)軸突損傷，極大程度上保護(hù)了神經(jīng)的完整性，這些數(shù)據(jù)均為補(bǔ)腎益髓膠囊的神經(jīng)保護(hù)作用提供了依據(jù)。但對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制還不清楚。

在MS或EAE發(fā)展過(guò)程中，幾類(lèi)免疫細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-1β和IL-4等細(xì)胞因子。研究證實(shí)，IL-1β在MS患者的血液、腦脊液和中樞神經(jīng)病變中均有明顯表達(dá)，EAE小鼠的病情在IL-1R和IL-1β缺乏中明顯減輕[16-17]，含IL-4的細(xì)胞外囊泡對(duì)MS小鼠神經(jīng)炎癥具有調(diào)節(jié)作用[18]。MG是腦內(nèi)固有的免疫細(xì)胞，在神經(jīng)炎癥中MG由靜息態(tài)被激活為M1或M2型極化態(tài)[19]。MG特異性表達(dá)Iba-1抗原，M1型MG細(xì)胞表達(dá)CD68等抗原，并釋放IL-1β、IL-6等因子，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和殺滅病原體等作用，過(guò)度表達(dá)對(duì)神經(jīng)組織也造成損害；M2型細(xì)胞可分泌IL-4等細(xì)胞因子，可抑制神經(jīng)炎癥。在MS急性期的脫髓鞘區(qū)域，M1型細(xì)胞明顯增多，在緩解期也表現(xiàn)為M1型細(xì)胞升高，造成神經(jīng)損傷，并使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化受阻，相關(guān)髓鞘蛋白等表達(dá)減弱，從而導(dǎo)致髓鞘再生失敗[20]。因此，降低M1型MG表達(dá)，調(diào)節(jié)M1/M2趨于平衡，是髓鞘再生修復(fù)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21-22]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EAE小鼠腦和脊髓中的Iba-1和CD68表達(dá)明顯增多，IL-1β也有明顯升高，而IL-4的含量則明顯降低，上述結(jié)果表明在EAE病理?xiàng)l件下，MG迅速激活，大量促炎因子被釋放，導(dǎo)致CNS急性炎癥反應(yīng)，IL-1β通過(guò)與其同源的IL-1Rs結(jié)合，以自分泌或旁分泌的方式進(jìn)一步刺激其自身產(chǎn)生，放大炎癥損傷信號(hào)[23]，這些細(xì)胞毒性物質(zhì)的產(chǎn)生損傷了神經(jīng)組織，病理表現(xiàn)腦和脊髓組織存在大量炎癥浸潤(rùn)和形成袖套樣改變，出現(xiàn)脫髓鞘和軸突變性。但經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎益髓方處理后，能夠明顯下調(diào)Iba-1和CD68表達(dá)，減少I(mǎi)L-1β的釋放，顯著增加IL-4含量，提示本方抑制CNS中MG或外周巨噬細(xì)胞的募集，在一定程度上抑制了MG的激活，抑制了過(guò)度的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)MG抗原遞呈作用，吞噬組織及髓鞘的碎片，減輕了EAE炎性損傷，因此神經(jīng)軸突和髓鞘得到了保護(hù)。

PPARs是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子[24]，其中激活的PPAR-γ可抑制單核細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-2等生成，產(chǎn)生抗炎作用[25]，并且還可抑制MG向M1極化，抑制促炎因子產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-4能誘導(dǎo)PPAR-γ激活，并提高M(jìn)G的IL-4受體表達(dá)[26]，IL-4的腸胃外給藥可促使腦PPAR-γ相關(guān)基因表達(dá)，PPAR-γ激動(dòng)劑可抑制EAE中的IL-12信號(hào)傳導(dǎo)和Th1分化來(lái)減輕神經(jīng)炎癥和脫髓鞘。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，補(bǔ)腎益髓膠囊能夠明顯上調(diào)EAE小鼠腦和脊髓PPAR-γ基因表達(dá)，推測(cè)本藥的抑炎作用可能與上調(diào)PPAR-γ信號(hào)通路有關(guān)。由于PPAR-γ通路復(fù)雜，其與JAK-STAT、PI3K/Akt信號(hào)通路等都有相互影響，因此，補(bǔ)腎益髓膠囊對(duì)PPAR-γ通路調(diào)節(jié)作用還待深入研究。

綜上，補(bǔ)腎益髓膠囊能夠調(diào)節(jié)EAE小鼠細(xì)胞免疫因子，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PPAR-γ表達(dá)有關(guān)。本研究為補(bǔ)腎生髓、化痰活血法治療MS的科學(xué)內(nèi)涵提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為中醫(yī)藥通過(guò)調(diào)節(jié)MG治療MS提供了新思路。