鄭智禮 史興華 于瀚 張億 高藝寧 魏偉莉 鄧秀蘭

“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”為仲景“治未病”的代表性原文。研究表明，實(shí)脾治肝常取得事半功倍的療效，但現(xiàn)有研究多集中在肝脾同病、同調(diào)狀態(tài)下的機(jī)制研究，而遵循《金匱要略》原旨，著眼于“當(dāng)先實(shí)脾”之“先”，探討其客觀性的相關(guān)報道乏陳?；诖?，本課題采用肝郁疊加慢性肝損傷大鼠模型，通過不同的分組及給藥方式，復(fù)制“當(dāng)先實(shí)脾”的治療方案。從肝功能生化指標(biāo)、肝組織病理學(xué)的觀察結(jié)果評價模型及藥效；從5h-尿木糖排泄率的檢測結(jié)果探討“知肝傳脾”的客觀性；通過對比正常組、模型組及各干預(yù)組上述指標(biāo)的變化，尋求 “當(dāng)先實(shí)脾”的生物學(xué)依據(jù)，通過檢測肝凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)、肝組織B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)的表達(dá)，觀察“當(dāng)先實(shí)脾”對肝細(xì)胞凋亡的影響，為豐富和發(fā)展中醫(yī)藥防治肝病做出有益的科學(xué)探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SD大鼠48只，雄性，體重(180±20)g，合格證號：SCXK(京)2016-0002，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供。飼于室溫(25±0.5)℃，相對濕度(55±5)%，采用 12小時明暗交替光照，自由攝食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及配置

陽性藥：雙環(huán)醇200 mg/kg[2-3]；柴芍六君子湯方：柴胡12 g、白芍15 g、黨參15 g、茯苓10 g、炙甘草5 g、白術(shù)10 g、法半夏10 g、陳皮10 g、枳殼10 g、焦三仙各10 g；四逆散方：柴胡12 g、白芍15 g、枳殼10 g、炙甘草5 g；六君子湯方：黨參15 g、茯苓10 g、炙甘草5 g、白術(shù)10 g、法半夏10 g、陳皮10 g、焦三仙各10 g。

實(shí)驗(yàn)用藥均購自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室鑒定，生藥劑量比例按原著換算。各組藥物常規(guī)煎煮3次，將3次濾液混合，將所得藥液紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮后貯于冰箱中備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

全自動生化分析儀(CX4Pro,BECKMANCOULTER,USA)；光學(xué)顯微鏡(BX53,OLYMPUS,JAPAN)；全波長酶標(biāo)儀(MultiskanGO,Thermo,USA)；熒光定量PCR儀(ABI,Steponeplus)；超微量分光光度計(Thermo,NanoDrop2000)。

尿木糖測試盒(A035，南京建成生物工程研究所)；GAPDH (GB12002，Servicebio)；Bax(GB11690，Servicebio)；Bcl-2(ab59348，abcam)；TUNEL試劑盒(11684817910，Roche)。

1.4 動物分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠分為6組，分別為正常組、模型組、雙環(huán)醇組、柴芍六君子湯甲組、柴芍六君子湯乙組、柴芍六君子湯丙組，每組8只。造模同時灌胃給藥，連續(xù)42天，正常對照組給予等容量純凈水。

參照慢性束縛法[1]，將模型組大鼠置于特制的束縛制動筒內(nèi)(北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司提供，長20 cm，內(nèi)徑5.5 cm，前端有滑塞，后部有壓板)，通過移動固定器前端的滑塞逐步縮小大鼠活動空間，調(diào)節(jié)到其無強(qiáng)烈反抗的最小空間。每日束縛制動1次，開始時間隨機(jī)，時長從第1天的4小時逐漸增至每天6小時，連續(xù)42天。所有大鼠在束縛期間禁食禁水。除正常組外，其余5組大鼠給予40%CCl4橄欖油溶液皮下注射(5 mL/kg體重，2次/7天)，正常組予等量橄欖油干預(yù)對照，見表1。

1.5 樣本采集與檢測方法

實(shí)驗(yàn)開始前1天分組稱重。各組于實(shí)驗(yàn)第42天禁食12小時后灌服10% 尿木糖溶液5 mL/只，代謝籠收集大鼠5小時的尿液，離心取上清(3000 r/分鐘,4℃,15分鐘)。麻醉取血，離心取上清(3500 r/分鐘, 4℃,15分鐘)，于-80℃凍存?zhèn)溆?。摘取肝組織右側(cè)葉置于4%多聚甲醛溶液中固定，左側(cè)葉及中葉于-80℃凍存以待檢測。

1.5.1 肝組織病理學(xué)觀察 肝組織4%多聚甲醛溶液固定后石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木素-伊紅(hema-toxylin-eosin，HE)染色后光鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.5.2 肝功能生化檢測 以全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、白蛋白(albumin，ALB)含量。

1.5.3 5h-尿木糖排泄率檢測 計算公式：5h-尿木糖排泄率=(測試樣濃度值×稀釋倍數(shù)×5h尿樣/1000)×100%

1.5.4 肝細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測 采用TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡。肝組織石蠟切片經(jīng)脫臘水化后修復(fù)、破膜，按試劑盒說明書添加試劑1 (TdT)和試劑2(dUTP)，后DAPI復(fù)染細(xì)胞核[切片用PBS(PH 7.4)洗滌3次，每次5分鐘。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10分鐘]，后再置于PBS(PH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5分鐘。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光掃描采集圖像，每張切片5個隨機(jī)視野，計算凋亡指數(shù)，陽性凋亡細(xì)胞核為綠色。凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.5.5 肝組織凋亡基因Bax及Bcl-2檢測 采用RT-PCR法檢測肝組織中Bax、Bcl-2的相對表達(dá)量。提取肝組織總RNA并進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，收集數(shù)據(jù)，確定每個樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值時的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，進(jìn)行分析繪制每一反應(yīng)管的擴(kuò)增動力學(xué)曲線，根據(jù)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)模板初始拷貝的對數(shù)值作圖，得到該樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)條件為50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，95℃ 15秒，60℃ 1分鐘，最后兩步重復(fù)40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度，所有樣本均重復(fù)3孔。引物設(shè)計方法見表2。

1.5.6 凋亡蛋白Bax及Bcl-2檢測 采用Western blot法檢測肝組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量。取適量肝組織冰上融化，細(xì)胞裂解液處理，離心后取上清，通過電泳將蛋白分開并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用含5%的脫脂奶粉(0.5%TBST配)封閉1小時。稀釋一抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA)，4℃孵育過夜(快轉(zhuǎn))，TBST室溫下脫色搖床上洗三次，每次5分鐘。二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30分鐘后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5分鐘，滴加熒光底物發(fā)光顯色。Photo Shop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，Prism 6軟件進(jìn)行灰度統(tǒng)計。

表2 引物設(shè)計表

表3 各組大鼠血清肝生化指標(biāo)對比

注： 與正常組對比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組對比，cP<0.05，dP<0.01。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果可見，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，核圓居中，無明顯腫脹、炎性細(xì)胞浸潤及壞死。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞腫脹明顯，并有炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞核明顯偏位。雙環(huán)醇組、柴芍六君子湯甲組、丙組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，部分肝細(xì)胞輕度腫脹，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。柴芍六君子湯乙組大鼠部分肝細(xì)胞變形明顯，部分細(xì)胞核移位，存在少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 血清肝功能生化檢測結(jié)果

模型組大鼠血清ALP、AST、ALT濃度顯著升高，ALB濃度顯著降低，雙環(huán)醇組、柴芍六君子湯甲組、乙組、丙組均可不同程度的改善肝郁疊加慢性肝損傷大鼠血清肝功能生化指標(biāo)的異常改變，其中復(fù)制“當(dāng)先實(shí)脾”治療方案的柴芍六君子湯丙組對該模型大鼠血清肝功能生化指標(biāo)的改善作用與雙環(huán)醇接近，對該模型的干預(yù)作用優(yōu)于其它中藥干預(yù)方法。見表3。

注：A 正常組；B 模型組；C雙環(huán)醇組；D柴芍六君子湯甲組；E柴芍六君子湯乙組；F柴芍六君子湯丙組。

圖1各組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果(HE×100)

2.3 5h-尿木糖排泄率檢測結(jié)果

模型組大鼠5h-尿木糖排泄率顯著降低，“先實(shí)脾”“先治肝”、雙環(huán)醇均可不同程度的提高肝郁疊加慢性肝損傷大鼠5h-尿木糖排泄率，“先實(shí)脾”、雙環(huán)醇對該模型大鼠5h-尿木糖排泄率的提高作用優(yōu)于“先治肝”的治療方式。見表4。

表4 各組大鼠5h-尿木糖排泄率對比

注： 與正常組對比，aP<0.05；與模型組對比，bP<0.05。

2.4 肝細(xì)胞凋亡計數(shù)檢測結(jié)果

模型組大鼠AI顯著高于正常組(P<0.01)；雙環(huán)醇組、柴芍六君子湯甲組、乙組、丙組AI顯著低于模型組(P<0.01)，其中丙組對肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)最佳(P<0.05,P<0.01)。見表5、圖2。

表5 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)對比

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與柴芍六君子湯丙組比較，cP<0.05，dP<0.01。

注：A-C正常組；D-F模型組；G-I雙環(huán)醇組；J-L柴芍六君子湯甲組；M-O柴芍六君子湯乙組；P-R柴芍六君子湯丙組。

圖2各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況(TUNEL熒光掃描凋亡細(xì)胞圖、正常細(xì)胞圖、合成圖 ×200)

2.5 肝細(xì)胞凋亡基因Bax、Bcl-2表達(dá)情況

模型組Bax基因表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.01)，Bcl-2基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.01)。雙環(huán)醇組及柴芍六君子湯甲組、乙組、丙組均有效改善模型大鼠肝組織Bax基因的異常表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。雙環(huán)醇組及柴芍甲組、丙組對模型大鼠肝組織Bcl-2的異常表達(dá)均有顯著改善(P<0.05)。各種干預(yù)方式均可有效降低模型大鼠肝組織Bax/Bcl-2的異常升高(P<0.05,P<0.01)，其中復(fù)制“當(dāng)先實(shí)脾”治療方案的柴芍丙組對該基因的干預(yù)作用優(yōu)于其它干預(yù)方式。見表6。

2.6 肝細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)情況

對比正常組，模型組大鼠Bax蛋白相對表達(dá)量升高但不顯著，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05)；對比模型組，雙環(huán)醇組及柴芍甲組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，雙環(huán)醇、柴芍乙、柴芍丙組Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05,P<0.01)。以上結(jié)果表明，雙環(huán)醇、柴芍乙及柴芍丙組均可有效降低肝郁疊加慢性肝損傷模型大鼠肝組織的凋亡情況，其中柴芍丙組對兩個蛋白相對表達(dá)量的干預(yù)作用最為顯著。見表7、圖3。

注：A:正常組；B:模型組；C:雙環(huán)醇組;D:柴芍六君子湯甲組;E:柴芍六君子湯乙組;F:柴芍六君子湯丙組

圖3各組大鼠肝組織Bax及Bcl-2蛋白泳道圖

3 討論

“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”是仲景“治未病”運(yùn)用的重要體現(xiàn)。然針對“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的研究多集中于肝脾同病、同調(diào)，而嚴(yán)格遵循《金匱要略》原旨，探討“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”客觀證據(jù)及生物學(xué)機(jī)制的研究鮮有報道，在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用肝郁疊加慢性肝損傷大鼠模型復(fù)制“見肝之病”，通過不同分組先后給予不同藥物干預(yù)，觀察“知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的生物學(xué)依據(jù)及其對肝細(xì)胞凋亡的影響。

表6 各組大鼠肝組織Bax及Bcl-2基因的表達(dá)情況

注： 與正常組對比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組對比，cP<0.05，dP<0.01。

表7 各組大鼠肝組織Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

注： 與正常組對比，aP<0.05；與模型組對比，bP<0.05，cP<0.01。

肝功能生化指標(biāo)、肝組織病理學(xué)觀察可以直觀反映肝臟病變程度，二者為本實(shí)驗(yàn)評價“肝病”的重要指標(biāo)。尿木糖主要在空腸內(nèi)通過被動擴(kuò)散的方式吸收，代謝過程不需肝臟、消化酶及腎小管參與，其吸收水平能夠反映小腸吸收水平[4-5]?？诜咎呛竽蛑信懦龅哪蚰咎钦扔谛∧c的被動吸收能力，檢測尿液5h-尿木糖排泄率可有效評價腸粘膜的吸收功能，為本實(shí)驗(yàn)評價“脾虛”的主要指標(biāo)。

細(xì)胞凋亡是多途徑、多基因調(diào)控下，自主有序的死亡過程[6-7]，這種生物過程的紊亂與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，有研究表明肝細(xì)胞凋亡的紊亂是急慢性肝損傷的主要原因之一，而AI則為常用的評價凋亡程度的指標(biāo)[8-9]。細(xì)胞凋亡途徑可以分為外源性和內(nèi)源性兩種，即死亡受體通路和線粒體通路[10-11]，而線粒體途徑則是公認(rèn)為的細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在眾多凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2家族是公認(rèn)最有效的多基因家族，其中目前被認(rèn)為和凋亡關(guān)系最密切的是Bcl-2和Bax。Bcl-2是公認(rèn)的凋亡抑制基因，它編碼的蛋白位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，其抗凋亡作用機(jī)制為通過抗氧化應(yīng)激及改善線粒體通透性，進(jìn)而減少細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子釋放，最終抑制凋亡效應(yīng)蛋白酶鏈激活[13-14]。當(dāng)Bcl-2過表達(dá)時，可形成Bcl-2同源二聚體，能有效抑制各種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而Bax是目前Bcl-2家族中被公認(rèn)的促凋亡基因，一般來講其定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞受到損傷或感受外源性刺激后，被激活的Bax結(jié)合在線粒體膜上，建立線粒體膜通道，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。而Bax過度表達(dá)時，則形成Bax同源二聚體，直接啟動或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用的發(fā)揮[16]。因此，Bcl-2與Bax表達(dá)水平的平衡決定了凋亡信號刺激后細(xì)胞的存活或凋亡。而Bax/Bcl-2比值直接反應(yīng)肝細(xì)胞凋亡程度，其改變可用以解釋干預(yù)細(xì)胞凋亡的因素是否發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的作用[7-8, 17]。AI、Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2為本實(shí)驗(yàn)評價肝細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)狀況的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清ALP、AST、ALT濃度顯著升高，ALB濃度顯著降低，肝組織病理學(xué)觀察存在炎癥、水腫等異常改變，提示模型組大鼠肝組織存在較嚴(yán)重病理損傷；模型組大鼠5h-尿木糖排泄率顯著降低，表明肝病的同時存在小腸被動吸收功能障礙，即“見肝之病，知肝傳脾”有其生物學(xué)依據(jù)。

各給藥組大鼠血清肝功能生化指標(biāo)、尿液5h-尿木糖排泄率及肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，各給藥組均可不同程度改善肝郁大鼠的肝功能、小腸被動吸收功能及肝組織病理損傷。三種中藥干預(yù)方式組間對比結(jié)果顯示，“當(dāng)先實(shí)脾”之柴芍六君子湯丙組對肝郁疊加慢性肝損傷大鼠血清ALB、ALT、AST濃度調(diào)控作用優(yōu)于其它給藥組，“當(dāng)先實(shí)脾”有其生物學(xué)依據(jù)。

模型大鼠AI指數(shù)顯著升高，Bax在基因及蛋白層面的表達(dá)均顯著升高，Bcl-2在兩種層面的表達(dá)顯著降低，Bax/Bcl-2顯著升高；雙環(huán)醇及三種中藥方劑干預(yù)方式均顯著降低模型大鼠的AI指數(shù)，其中柴芍丙組AI指數(shù)降低程度最接近正常組。從基因?qū)用婧偷鞍讓用鎭砜?，柴芍乙、丙組對Bcl-2、Bax的異常改變均具有調(diào)控作用，抗凋亡作用顯著，其中柴芍丙組即復(fù)制“當(dāng)先實(shí)脾”的治療方案對凋亡基因/蛋白的異常表達(dá)調(diào)控效果最佳。

本研究表明，“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”有其生物學(xué)依據(jù)，“當(dāng)先實(shí)脾”對肝郁疊加慢性肝損傷模型大鼠取得較好的干預(yù)作用可能與其對肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，肝細(xì)胞凋亡為“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的生物學(xué)機(jī)制之一。