姜冬梅，康波

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

生物體內(nèi)的多胺(腐胺、亞精胺和精胺)含量受到精密而嚴(yán)格的調(diào)控[1-2].多胺分解代謝過(guò)程中可產(chǎn)生多種活性醛(如丙烯醛)和H2O2，而這些物質(zhì)累積過(guò)多會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷[3].此外，多胺分解代謝產(chǎn)物還可通過(guò)損傷細(xì)胞來(lái)促使游離多胺的釋放，進(jìn)一步激活氧化分解代謝途徑，使損傷加劇[4-5].因此，機(jī)體內(nèi)過(guò)量的多胺具有誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用[6-9].研究表明，0.15 mmol/L亞精胺可通過(guò)其代謝產(chǎn)生的H2O2來(lái)抑制FM3A細(xì)胞增殖[10].Kwak等[11]研究表明，外源性亞精胺和精胺會(huì)使得多胺氧化代謝加劇，從而激活Nrf2-Keap1-ARE抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，進(jìn)而影響小鼠角化細(xì)胞中依賴(lài)還原型輔酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表達(dá).Yang等[12]利用亞精胺處理人內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果表明，亞精胺通過(guò)提高內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平來(lái)上調(diào)血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO-1)的轉(zhuǎn)錄和翻譯.總之，機(jī)體內(nèi)過(guò)量多胺可在胺氧化酶的作用下分解產(chǎn)生丙烯醛和H2O2，而外源性亞精胺可誘導(dǎo)多種細(xì)胞氧化應(yīng)激，甚至造成氧化損傷.

研究表明，氧化應(yīng)激在女性生殖系統(tǒng)功能的維持和生殖疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征和不明原因的不孕癥)的致病過(guò)程中具有重要作用[13].如前所述，外源性亞精胺可誘導(dǎo)離體細(xì)胞的氧化損傷.然而，在體水平上，外源性亞精胺誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物卵巢氧化損傷的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，本研究用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)亞精胺腹腔注射成年雌性小鼠，研究亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織形態(tài)、過(guò)氧化物酶(catalase,CAT)活性、丙二醛(molondialdehyde，MDA)水平以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量的影響，從在體水平上探究亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織氧化損傷的作用，以期為進(jìn)一步研究亞精胺誘導(dǎo)卵巢組織氧化損傷的作用機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

選取雌性健康昆明小鼠(SPF級(jí)試驗(yàn)用昆明系小鼠，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，小鼠自由采食.6周齡時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別腹腔注射生理鹽水(CK)和0.05、0.10、0.15 mg/g(體質(zhì)量)亞精胺.注射亞精胺后24、48 h時(shí)頸部脫臼處死小鼠，迅速采集小鼠卵巢組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干后，每組取部分卵巢組織樣品用4%多聚甲醛固定，其余樣品置于-80 ℃冰箱保存.亞精胺購(gòu)于Sigma公司，4%多聚甲醛購(gòu)于碧云天生物有限公司.

1.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

卵巢組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，取出組織進(jìn)行石蠟包埋和切片(片厚4 μm)，蘇木精-伊紅染色，用中性樹(shù)膠封片后，于倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，Japan)下進(jìn)行卵巢組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察并進(jìn)行圖像采集和分析.

1.3 卵巢組織中CAT酶活性和MDA水平檢測(cè)

取凍存卵巢組織，加入預(yù)冷的PBS后，使用電動(dòng)勻漿器研磨勻漿，4 ℃，3 000 r/min離心10 min后取上清液，參照BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(碧云天生物有限公司，上海)測(cè)定蛋白濃度后，按照CAT活性和MDA含量檢測(cè)試劑盒(碧云天生物有限公司，上海)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，并計(jì)算小鼠卵巢組織中CAT活性和MDA水平.

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

參照RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa公司，大連)說(shuō)明書(shū)提取小鼠卵巢組織總RNA，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)(TaKaRa公司，大連)將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，置于-20 ℃冰箱中保存，備用.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Primer premier 5.0和Oligo 6.0軟件分別設(shè)計(jì)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、CAT、NQO1和HO-1基因特異性引物(見(jiàn)表1)，華大基因有限公司合成相應(yīng)引物.實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系(10 μL)：iQTMSYBR Green Supermix(Bio-Rad，北京)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，cDNA模板0.5 μL，用無(wú)RNA酶水補(bǔ)足至10 μL.反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，57～64.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s(采集熒光)，40個(gè)循環(huán)；95 ℃保持10 s，繪制溶解曲線(xiàn).用β-ACTIN基因作為內(nèi)參基因.每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù).

表1 熒光定量 PCR 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用2-△△Ct法處理熒光定量數(shù)據(jù)，計(jì)算各處理組卵巢組織中目的基因相對(duì)表達(dá)量.利用SAS9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件MEANS過(guò)程進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，ANOVA過(guò)程進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較，數(shù)據(jù)用Mean±SEM表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織形態(tài)的影響

亞精胺處理24 h時(shí)，0.05 mg/g亞精胺處理組和對(duì)照組小鼠卵巢形態(tài)規(guī)整，可見(jiàn)各級(jí)發(fā)育的卵泡，皮質(zhì)區(qū)原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡及成熟卵泡數(shù)量及形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞形態(tài)較完整，排列整齊(圖1A～1B)；0.10 mg/g亞精胺處理組小鼠卵巢組織中部分卵泡形態(tài)和顆粒細(xì)胞排列不規(guī)整(圖1C)；0.15 mg/g亞精胺處理組小鼠卵巢組織中原始卵泡數(shù)量較對(duì)照組有所增加，且部分卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，卵母細(xì)胞皺縮且形態(tài)異常，顆粒細(xì)胞排列紊亂，部分卵泡膜損傷(圖1D).亞精胺處理48 h時(shí)，0.05 mg/g亞精胺處理組和對(duì)照組小鼠卵巢形態(tài)無(wú)明顯差異(圖1E～1F)；0.10 mg/g亞精胺處理組小鼠卵巢組織中部分卵泡形態(tài)和顆粒細(xì)胞排列不規(guī)整(圖1G)；0.15 mg/g亞精胺處理組小鼠卵巢組織中原始卵泡數(shù)量有所增加，且部分卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，卵母細(xì)胞皺縮且形態(tài)異常，顆粒細(xì)胞排列紊亂，部分卵泡膜損傷(圖1H).

A、B、C、D分別為對(duì)照組、0.05、0.10、0.15 mg/g亞精胺處理24 h后小鼠卵巢HE染色切片結(jié)果；E、F、G、H分別為對(duì)照組、0.05、0.10、0.15 mg/g亞精胺處理48 h后，小鼠卵巢HE染色切片結(jié)果.A,B,C and D represent ovarian HE staining in mice treated with the normal saline,0.05、0.10 、0.15 mg/g spermidine for 24 h,respectively；E,F,G and H represent ovarian HE staining in mice treated with the normal saline,0.05,0.10 and 0.15 mg/g spermidine for 48 h,respectively.圖1 亞精胺對(duì)雌性小鼠卵巢組織形態(tài)的影響(HE×100)Figure 1 Effect of spermidine on ovarian histology in female mice(HE×100)

2.2 亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織CAT活性和MDA水平的影響

由圖2可知，0.15 mg/g亞精胺處理24 h時(shí)，小鼠卵巢CAT活性極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；0.10、0.15 mg/g亞精胺處理48 h時(shí)，小鼠卵巢CAT活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其余亞精胺處理組小鼠卵巢組織CAT活性與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05).0.15 mg/g亞精胺處理24 h時(shí)，小鼠卵巢MDA水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，其余亞精胺處理組小鼠卵巢組織MDA水平與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05).

2.3 亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3可知，0.15 mg/g亞精胺處理組小鼠卵巢CAT、SOD、NQO1和HO-1基因mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01).其余各處理組抗氧化酶基因mRNA水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05).

*表示差異顯著(PP* indicates significant difference (PP圖2 亞精胺對(duì)雌性小鼠卵巢組織CAT活性和MDA水平的影響Figure 2 Effect of spermidine on the activity of CAT and content of MDA in ovaries of female mice

圖3 亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 3 Effect of spermidine on the expression levels of genes related to oxidase stress in ovaries of female mice

3 討論

亞精胺是自然界廣泛存在的一種低分子量的脂肪族化合物.生物體內(nèi)適量多胺可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的功能，然而當(dāng)多胺過(guò)量時(shí)會(huì)通過(guò)多胺分解代謝途徑產(chǎn)生丙烯醛和H2O2，進(jìn)而造成氧化損傷.卵巢氧化損傷可阻滯卵母細(xì)胞成熟和卵子發(fā)育，甚至?xí)斐陕雅蓍]鎖，嚴(yán)重影響雌性動(dòng)物的生殖功能.Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢發(fā)生氧化損傷時(shí)，卵巢組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，卵巢中結(jié)構(gòu)完整的卵泡數(shù)量減少，卵泡發(fā)育停滯，初級(jí)卵泡數(shù)量明顯增加.曹燕花等[15]研究表明小鼠卵巢氧化損傷會(huì)抑制卵泡發(fā)育成熟，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢組織中初級(jí)卵泡數(shù)量增加.本研究發(fā)現(xiàn)，隨著亞精胺處理濃度的增加或亞精胺處理時(shí)間的增長(zhǎng)，小鼠卵巢組織呈現(xiàn)出了上述研究相似的表型變化，如卵巢組織形態(tài)愈發(fā)不規(guī)整，初級(jí)卵泡數(shù)量顯著增加，卵母細(xì)胞皺縮，卵泡顆粒細(xì)胞排列紊亂等.已有研究證實(shí)，亞精胺可誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和小鼠顱腦氧化損傷[16-17]，而本研究結(jié)果表明一定濃度的亞精胺也可誘導(dǎo)小鼠卵巢組織氧化損傷.

機(jī)體內(nèi)許多病理現(xiàn)象均與自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化密切相關(guān)[18-19].CAT是機(jī)體酶抗氧化系統(tǒng)中的重要酶，具有清除H2O2，間接抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞膜損傷的作用.MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[20-21].MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，因此可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的指標(biāo)[22-23].研究表明，機(jī)體發(fā)生氧化損傷時(shí)通常伴隨著CAT活性的下降及MDA水平的升高[24-25].本研究發(fā)現(xiàn)，0.15 mg/g亞精胺處理24 h時(shí)，小鼠卵巢組織CAT活性顯著低于對(duì)照組，同時(shí)MDA水平顯著高于對(duì)照組，這與上述研究結(jié)果相一致，說(shuō)明0.15 mg/g亞精胺處理可導(dǎo)致小鼠卵巢組織發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而造成卵巢組織氧化損傷.此后，隨著亞精胺處理時(shí)間的增長(zhǎng)，0.10、0.15 mg/g亞精胺處理卵巢組織CAT活性均顯著低于對(duì)照組，這說(shuō)明亞精胺誘導(dǎo)小鼠卵巢氧化損傷不僅表現(xiàn)為劑量效應(yīng)也表現(xiàn)為時(shí)間效應(yīng).然而，本研究還發(fā)現(xiàn)不同濃度亞精胺處理48 h時(shí)，小鼠卵巢組織MDA含量與對(duì)照組均無(wú)顯著變化，其原因仍有待進(jìn)一步研究闡明.

如前所述，外源性亞精胺可導(dǎo)致多胺分解代謝加劇，進(jìn)而提高NQO1和HO-1轉(zhuǎn)錄和翻譯[11-12].本研究發(fā)現(xiàn)，0.15 mg/g亞精胺處理24、48 h時(shí)，小鼠卵巢組織NQO1和HO-1基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步從在體水平證實(shí)了高劑量亞精胺可通過(guò)加劇多胺分解代謝途徑以促進(jìn)NQO1和HO-1基因的轉(zhuǎn)錄.此外，本研究還發(fā)現(xiàn)0.15 mg/g亞精胺處理顯著增加了CAT和SOD基因轉(zhuǎn)錄.我們前期研究發(fā)現(xiàn)[26]，腹腔注射0.15 mg/g亞精胺時(shí)，處理組小鼠卵巢組織亞精胺含量不但沒(méi)有增加，反而顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明為維持多胺穩(wěn)態(tài)，卵巢組織加速了亞精胺分解代謝.這個(gè)過(guò)程勢(shì)必導(dǎo)致卵巢組織多胺代謝產(chǎn)物丙烯醛和H2O2累積，后者誘導(dǎo)卵巢組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而促進(jìn)了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中CAT和SOD基因表達(dá)以緩解氧化應(yīng)激.

4 結(jié)論

0.15 mg/g亞精胺可通過(guò)抑制CAT活性，降低卵巢組織抗氧化能力，誘導(dǎo)小鼠卵巢組織脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而造成小鼠卵巢組織氧化損傷.