朱海霞，馬永強(qiáng)

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)HZ-1分離于自然感病的老鸛草植株葉片，由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存.通過(guò)前期的純化及致病性研究，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)藜、冬葵等闊葉雜草具有致病力，接種后可導(dǎo)致雜草葉片不同程度的發(fā)黃、枯萎，甚至枯死.安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，該菌株除對(duì)春油菜表現(xiàn)不安全外，對(duì)當(dāng)?shù)刂髟宰魑锴囡?、蠶豆、春小麥和豌豆4種作物表現(xiàn)安全.該菌株有望開(kāi)發(fā)成為春小麥、蠶豆、豌豆和青稞田部分農(nóng)田闊葉雜草生物除草劑[1].

極細(xì)鏈格孢菌既是重要的植物病原菌，又是非常有應(yīng)用潛力的生物資源，除了生物除草劑領(lǐng)域，極細(xì)鏈格孢菌在病蟲(chóng)害生物防治、品種選育等方面都具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[2].另外，邱德文等[3]研究發(fā)現(xiàn)該菌能產(chǎn)生具有抗病增產(chǎn)功能的蛋白激發(fā)子，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)等方面具有廣泛的利用前景.如果將該菌株開(kāi)發(fā)成菌劑，可為生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ).

生防菌劑的生產(chǎn)與應(yīng)用，發(fā)酵技術(shù)是關(guān)鍵[4-5].真菌發(fā)酵一般采用液體發(fā)酵和液固雙相發(fā)酵.液體發(fā)酵菌劑使用方便，且工藝成熟，但存在菌劑保存時(shí)間短，生產(chǎn)成本高，代謝物利用不充分等弊端；而固體發(fā)酵具有能耗低，濕度低，培養(yǎng)基來(lái)源廣泛等優(yōu)越性[6-8].兩種菌劑各有優(yōu)點(diǎn)，為了滿足不同情況下對(duì)菌劑劑型的不同需求，本研究擬采用液固雙相發(fā)酵方式，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本.通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選菌株HZ-1附加碳、氮源和固態(tài)發(fā)酵底物基質(zhì)，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選菌株固液培養(yǎng)優(yōu)化條件，旨在為該菌的發(fā)酵工藝提供科學(xué)基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)微生物制劑的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)和指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)HZ-1分離于自然感病的老鸛草，由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存(圖1).

圖1 HZ-1菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Figure 1 Colony growth of HZ-1 strain on PDA medium

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 生防菌株固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選 HZ-1菌株在PDA斜面上培養(yǎng)7 d，加入5 mL無(wú)菌水制成菌懸液，按2%的接種量接種于PDB中，180 r/min、25 ℃振蕩培養(yǎng)5 d后獲得發(fā)酵液，稀釋成孢子量為1×108個(gè)/mL的種子液備用.選取玉米粉、菜籽餅、小麥秸稈、羊糞、麥麩等廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品下腳料作為固體發(fā)酵培養(yǎng)的基本材料，通過(guò)生防菌株固體基質(zhì)發(fā)酵初步確定對(duì)菌株HZ-1 生長(zhǎng)促進(jìn)作用最大的基質(zhì).每100 g固態(tài)基質(zhì)接種25 mL孢子量為1×108個(gè)/mL的種子液，攪拌均勻后，置于生化培養(yǎng)箱中25 ℃靜置培養(yǎng)8 d，取出發(fā)酵產(chǎn)物，自然烘干、粉碎，平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定不同基質(zhì)處理的活菌數(shù)，分光光度法測(cè)其吸光值(OD).每處理設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.2.2 碳、氮源單因素的確定 PDA作為基本培養(yǎng)基，選用6種附加碳源(可溶性淀粉、麥麩、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麥粉)和7種附加氮源(大豆粉、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、尿素、酒糟)，構(gòu)成13組不同培養(yǎng)基，以不加碳氮源的培養(yǎng)基作空白對(duì)照，將配置好的培養(yǎng)基滅菌后，倒皿并于中央接種5 mmHZ-1菌餅.25 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)量菌落直徑，每處理設(shè)置3次重復(fù)，篩選出能促進(jìn)菌株HZ-1生長(zhǎng)的碳氮源.

1.2.3 固-液發(fā)酵條件的優(yōu)化 采用L25(57)正交試驗(yàn)法，測(cè)定碳源蛋白胨、氮源麥麩、初始pH值、初始含水量、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間7種因素對(duì)菌株HZ-1發(fā)酵的影響.每種因素各取5個(gè)水平(表1).選擇麥麩作為發(fā)酵底物，根據(jù)不同配方配制各固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，濕熱滅菌后，依次接入孢子量為1×108個(gè)/mL的HZ-1種子液，攪拌均勻，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng).不同處理發(fā)酵物自然風(fēng)干、粉碎，無(wú)菌水溶解過(guò)濾去雜質(zhì)后，采用平板涂布法，以活菌數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù).正交試驗(yàn)共有49個(gè)處理水平，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2.

表1 菌株HZ-1發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

表2 正交試驗(yàn)的不同處理水平

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)基質(zhì)篩選

不同發(fā)酵基質(zhì)對(duì)菌株HZ-1產(chǎn)孢量不同，在等量發(fā)酵基質(zhì)和種子液接入量的前提下，麥麩的產(chǎn)孢量顯著高于其他基質(zhì)，產(chǎn)孢量lgCFU值為8.01，OD值為0.652 4.

表3 不同基質(zhì)對(duì)HZ-1菌粉含孢量和孢子液吸光值的影響

HZ-1在固態(tài)基質(zhì)上的生長(zhǎng)狀況由優(yōu)到弱依次為麥麩>小麥秸稈>菜籽餅>玉米粉>羊糞>珍珠巖，玉米粉與菜籽餅處理的產(chǎn)孢量之間不存在顯著性差異，玉米粉、菜籽餅和小麥秸稈OD值間不存在顯著性差異，其余基質(zhì)處理間均存在顯著性差異.因此，HZ-1最適產(chǎn)孢的固態(tài)基質(zhì)為麥麩.圖1顯示該菌株在麥麩基質(zhì)上的生長(zhǎng)情況.

2.2 附加碳源和氮源的篩選

HZ-1在不同碳氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑，在培養(yǎng)的第3天測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4.不同碳、氮源對(duì)菌株HZ-1生長(zhǎng)影響的方差分析結(jié)果可以看出(表4)，碳源方面，麥麩培養(yǎng)基上菌落直徑生長(zhǎng)最快，高于對(duì)照及其他處理，玉米粉、葡萄糖及小麥粉次之，可溶性淀粉、蔗糖2種碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用.其中，葡萄糖、玉米粉和小麥粉處理間不存在顯著差異，其余處理間均存在顯著性差異.因此，選取麥麩作為碳源；氮源方面，大豆粉、硫酸銨和酒糟處理后菌株生長(zhǎng)較對(duì)照緩慢，這3種氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用；尿素完全抑制菌絲生長(zhǎng)，菌落直徑為0，蛋白胨、酵母浸粉和硝酸鈉處理培養(yǎng)基上菌絲菌落生長(zhǎng)較好，其產(chǎn)孢量高，與其他處理比較差異顯著.試驗(yàn)選取蛋白胨為氮源進(jìn)行下一步研究.

表4 HZ-1在不同碳氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑比較

小寫(xiě)字母表示差異顯著性(P<0.05)，大寫(xiě)字母表示差異顯著性(P<0.01).

Lowercase letters represent the significance of difference at the level ofF0.05and uppercase letters represent the significance of difference at the level ofF0.01.

圖2 HZ-1菌株在麥麩基質(zhì)上的生長(zhǎng)情況Figure 2 Growth of HZ-1 strain on wheat bran matrix

碳源可溶性淀粉、麥麩、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麥粉.Carbon soyuce：amylogen,wheat bran,saccharose,amylaceum,corn meal,wheat meal.圖3 HZ-1在6種碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Figure 3 HZ-1 growth on 6 carbon source media

氮源硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母浸粉.Nitrogen source：NH4)2SO4,NaNO3,peptone,yeast powder.圖4 HZ-1在4種氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Figure 4 Growth of hz-1 on four nitrogen source media

2.3 最佳培養(yǎng)條件的確定

對(duì)菌株HZ-1固液發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.菌株HZ-1固態(tài)發(fā)酵統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表6.7種因素極差R值從大到小依次是：培養(yǎng)溫度(3.25)、培養(yǎng)時(shí)間(2.71)、N源(2.52)、初始含水量(1.27)、C源(1.26)、初始PH值(1.2)、接種量(1.06).因此，影響菌株HZ-1固態(tài)發(fā)酵條件的因素作用由大到小依次為：培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>N源>初始含水量>C源>初始PH值>接種量.從各水平的統(tǒng)計(jì)A值比較來(lái)看，適合菌株HZ-1固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為：N源蛋白胨50 mg/g、C源麥麩40 mg/g、培養(yǎng)基初始含水量300 mg/g、接種量0.3 mL/g、初始pH 7.4、最佳培養(yǎng)時(shí)間216 h和培養(yǎng)溫度24.3 ℃.

表5 菌株HZ-1固態(tài)發(fā)酵含孢量的正交試驗(yàn)直觀分析表

表6 菌株HZ-1 固態(tài)發(fā)酵菌粉含孢量的正交試驗(yàn)結(jié)果

Ai表示同一列中編號(hào)為i的所有指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果之和.

Airepresents the sum of test results of all indexes numberediin the same column.

硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母浸粉.(NH4)2SO4,NaNO3,peptone,yeast powder.圖5 正交試驗(yàn)確定菌株HZ-1培養(yǎng)條件Figure 5 Orthogonal test to determine the culture conditions of HZ-1

3 討論

菌株HZ-1是從青海省獨(dú)特的氣候及生態(tài)條件下篩選出來(lái)的，具有較強(qiáng)的除草活性，且安全性高，環(huán)境兼容性好[1].本研究通過(guò)固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)及碳氮源篩選，菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定了該菌株發(fā)酵的各項(xiàng)工藝參數(shù)指標(biāo).

研究微生物發(fā)酵所需的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件是提高產(chǎn)孢量的一條途徑和思路[9-12].對(duì)于生防菌株而言，發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件直接影響菌株的生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物的調(diào)控，進(jìn)而影響生物活性的強(qiáng)弱[13-15].生防菌株具有不同的發(fā)酵特性和營(yíng)養(yǎng)需求，最適發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基組分差異較大[16-17].研究表明HZ-1最適碳源為麥麩，最適氮源為蛋白胨.篩選出的最適產(chǎn)孢固態(tài)基質(zhì)麥麩，適用于大批量生產(chǎn)，方便菌劑儲(chǔ)存和運(yùn)輸[18-20].微生物發(fā)酵受多種生物和非生物因子的影響，碳氮源、基質(zhì)含水量、接種量、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等因素是發(fā)酵過(guò)程中極為關(guān)鍵的控制和檢測(cè)參數(shù)，可直接影響到菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[21-25].通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出菌株HZ-1最佳培養(yǎng)基含水量、最適接種量、最適溫度、最適發(fā)酵時(shí)間.對(duì)于菌株HZ-1的發(fā)酵生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō)，明確各因素與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系，得到最優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)，將為該菌的劑型研究和規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考.

本研究只在實(shí)驗(yàn)室里對(duì)極細(xì)鏈格孢HZ-1培養(yǎng)基的組成及其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)配方可為下一步中試生產(chǎn)提供技術(shù)支撐，但優(yōu)化后的配方和發(fā)酵條件是否符合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還需進(jìn)行大體積發(fā)酵罐實(shí)際驗(yàn)證.

4 結(jié)論

本研究確定了除草活性菌株HZ-1固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)、最適碳氮源和固-液發(fā)酵條件.單因素試驗(yàn)篩選出該菌株最佳產(chǎn)孢的固態(tài)基質(zhì)為麥麩，最適碳源為麥麩，最適氮源為蛋白胨(50 mg/g).正交優(yōu)化試驗(yàn)得出該菌最適固-液發(fā)酵條件為：蛋白胨50 mg/g，麥麩40 mg/g，培養(yǎng)基初始含水量300 mg/g，適宜的接種量0.3 mL/g，初始pH值7.4，最適溫度24.3 ℃，發(fā)酵最適時(shí)間為216 h.