崔丹丹，楊巧玲，張俊蓮，張峰

(1．甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

激素在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用[1].茉莉酸及其活性衍生物統(tǒng)稱為茉莉酸類物質(jasmonates,JAs)，是廣泛存在于植物中一類重要植物激素，不僅參與調控植物生根、抑制種子萌發(fā)、加速細胞分裂、促進衰老等生長發(fā)育過程[2-6]，還調節(jié)植物對病原菌侵害、干旱脅迫、鹽脅迫和機械損傷等脅迫響應[7].茉莉酸類物質的合成主要包括三個階段，分別在不同的亞細胞結構中完成，從不飽和脂肪酸到12-氧-植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid,OPDA)的合成是在葉綠體中進行，從 OPDA到JA的轉化是在過氧化物酶體中進，進一步的修飾則在細胞質中進行[8-9].

馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育過程分為匍匐莖誘導和發(fā)生、匍匐莖伸長生長、匍匐莖縱向生長停止、塊莖發(fā)生及膨大等四個階段[10]，受多種植物激素調控.研究表明，JA可以促進馬鈴薯塊莖細胞的分裂和膨大，有利于塊莖形成和發(fā)育[11-12].脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是JA生物合成過程的關鍵酶，參與早期馬鈴薯塊莖膨大[13].外源施加JA生物合成抑制劑水楊苷羥肟酸(salicylhydroxamic acid,SHAM)會抑制LOX活性，當LOX活性受到抑制時，使內源JA合成受阻，從而抑制馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育[14-16].使用濃度為10 μmol/L的JA處理馬鈴薯試管苗單節(jié)莖段，結薯率幾乎接近100%[17]；單獨施加SHAM時，馬鈴薯塊莖形成受阻，單薯鮮質量減小[18].塊莖生育期內淀粉含量與其它糖類物質含量都影響馬鈴薯塊莖形成[19].外源施加JA后，馬鈴薯離體塊莖淀粉、還原糖和可溶性糖含量均顯著增加[20].本研究選取馬鈴薯試管苗誘導的匍匐莖為材料，通過對匍匐莖施加不同濃度JA生物合成抑制劑SHAM，分析抑制劑作用下的JA對馬鈴薯離體塊莖誘導的影響，為深入研究JA對馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育過程中的調控機理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)普通栽培品種“大西洋”試管苗(由甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室提供)為供試材料.

1.2 材料培養(yǎng)

將試管苗接種到MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度(22±1)℃，光照時間16 h/d，光照強度2 000 lx，30 d后轉入含1.5 g/L活性炭的MS液體誘導培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)產生匍匐莖.將生理狀態(tài)一致的匍匐莖接入含有不同濃度SHAM改良后的1/10 MS液體培養(yǎng)基[21]，同時篩選出匍匐莖膨大完全抑制時的抑制劑濃度，與5 μmol/L JA共同處理匍匐莖，對照CK為不加JA及其生物合成抑制劑，每個處理5次重復.培養(yǎng)40 d后，收集誘導形成的離體塊莖，液氮速凍，-80 ℃保存.

1.3 試驗方法

1.3.1 馬鈴薯塊莖形態(tài)觀察與生物量測定 離體誘導培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計不同濃度JA生物合成抑制劑SHAM處理下匍匐莖結薯率，稱量塊莖鮮質量，用游標卡尺測量塊莖直徑，稱量塊莖鮮質量后在80 ℃下烘干至恒質量，并記錄塊莖干質量.

1.3.2 馬鈴薯塊莖LOX活性測定 LOX活性測定采取Sakai和Zhao的方法[20]，具體如下：反應底物制備：酶反應底物由2 mL 0.1 mol/L Na2HPO4(pH 9.0)緩沖液、0.1 mL Tween-20溶液和0.1 mL亞油酸(C18H32O2)溶液充分混勻，用0.5 mol/L NaOH滴定至溶液澄清，定容至25 mL.粗酶液提?。悍Q取 0.5 g馬鈴薯塊莖，加入2.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(1% PVP(W/V)，1 mmol/L CaCl2，5 mmol/L DTT，10%(V/V)甘油，pH 8.0).冰上研磨至勻漿，4℃，12 000g離心15 min，重復2次，合并上清備用.(3)酶活性測定：加入0.2 mL酶反應底物、2.8 mL 0.1 mol/L Na2HPO4緩沖液(pH 9.0)和酶提取液50 μL組成酶反應混合液，反應溫度為30 ℃，加酶液后分別在15 s和75 s后記錄234 nm下吸光值.

1.3.3 碳水化合物含量的測定 淀粉含量測定根據(jù)Nelson方法[21]稍加改進.稱取0.5 g馬鈴薯塊莖，加入4 mL 80%乙醇研磨至勻漿，沸水浴10 min，4 ℃，12 000g離心15 min，棄上清.向沉淀中加入2 mL蒸餾水，沸水中進行10 min糊化反應，冷卻后加入5 mL 35% HClO4溶液攪拌15 min，蒸餾水定容至25 mL，過濾后溶液補足為100 mL測定吸光值.

葡萄糖、蔗糖和果糖含量的測定參照Guimberteau和Halhoul方法[22]稍加改進：稱0.1 g馬鈴薯塊莖，加入1 mL蒸餾水，研磨至勻漿，轉入離心管，加入2 mL蒸餾水，25 ℃，6 000g離心5 min，吸取上清2 mL，加入2 mL蒸餾水，重復三次，收集6 mL上清液定容至10 mL.果糖含量測定：取1 mL上清液，加入3 mL蒽酮，25 ℃常溫顯色5 min，640 nm波長下測吸光值.蔗糖含量測定：取2 mL上清液，加入1 mL KOH，水浴10 min，水浴冷卻后取1 mL，加3 mL蒽酮，水浴5 min，冷卻后，640 nm波長下測吸光值.葡萄糖含量測定：取1 mL上清液，加入3 mL蒽酮，沸水浴5 min，冷卻后，640 nm波長下測吸光值.

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 水楊苷羥肟酸(SHAM)處理后馬鈴薯離體塊莖形態(tài)變化

不同濃度SHAM(0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 200、1 300、1 400、1 500、1 800、1 900、2 000、2 100、2 200、2 300、2 400 μmol/L)處理馬鈴薯匍匐莖，培養(yǎng)40 d后形成的塊莖形態(tài)差異顯著(圖1 A).隨著SHAM濃度增加，匍匐莖結薯率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢.當SHAM濃度為300 μmol/L、900 μmol/L和1 800 μmol/L時，結薯率下降較為顯著，分別比對照下降了12.11%、29.61%和85.3%；當SHAM濃度達到2 400 μmol/L時，匍匐莖不再發(fā)生膨大形成塊莖(圖1-B).隨著SHAM濃度增加，塊莖直徑逐漸減小.當SHAM濃度為600、1 500、1 800、2 100 μmol/L時，塊莖直徑顯著下降，分別比對照降低了15.54%、37.82%、43.62%和54.41%(圖1-C).同樣，塊莖鮮質量也隨著SHAM濃度的增加逐漸下降.當SHAM濃度在100～400 μmol/L范圍內時，塊莖鮮質量急劇下降，而在400～2 000 μmol/L的濃度范圍內，塊莖鮮質量下降趨勢逐漸變緩，其中在SHAM濃度為1 500 μmol/L和2 100 μmol/L時，塊莖鮮質量分別比對照下降了62.68%和74.29%(圖1-D).塊莖干質量也隨著SHAM濃度的增加逐漸下降.當SHAM濃度在100～400 μmol/L范圍內時，塊莖干質量急劇下降，當SHAM濃度在500～1 300 μmol/L范圍內時，塊莖干質量下降趨勢逐漸變緩，其中在SHAM濃度為400 μmol/L時，塊莖干質量比對照下降了37.57%(圖1-E).

2.2 水楊苷羥肟酸(SHAM)處理的馬鈴薯離體塊莖脂氧合酶活性變化

LOX是JA合成過程中的第一個關鍵酶，其活性影響著JA的生物合成積累，進而影響著塊莖的形成和發(fā)育.結果表明，隨著SHAM濃度的增加，LOX活性整體呈現(xiàn)降低趨勢.在SHAM濃度為600 μmol/L時，LOX活性最高，比對照增加了4.23%.在SHAM濃度為2 400 μmol/L時，LOX活性最低，比對照降低了88.12%(圖2).

2.3 水楊苷羥肟酸(SHAM)處理的馬鈴薯離體塊莖碳水化合物含量變化

塊莖中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢.在SHAM濃度介于100～900 μmol/L范圍時，隨著SHAM 濃度的增加，葡萄糖含量逐漸降低，濃度為900 μmol/L時最低(0.08 mg/g)，比對照減少了97.1%；在SHAM濃度介于900～2 400 μmol/L濃度時，隨著SHAM 濃度的增加，葡萄糖含量逐漸增加，在2 400 μmol/L時含量最高(8.81 mg/g)，比對照增加了2.1倍(圖3-A).果糖含量在SHAM濃度介于100～600 μmol/L內時，隨著SHAM 濃度增加葡萄糖含量逐漸降低，在600 μmol/L時含量最低(4.00 mg/g)，比對照減少了87.5%；在SHAM濃度介于600～2 400 μmol/L時，隨著SHAM 濃度增加果糖含量逐漸增加，在2 400 μmol/L時含量最高(33.27 mg/g)，與對照相比增加了0.33倍(圖3-B).蔗糖含量在SHAM濃度介于900～2 400 μmol/L時，隨著SHAM 濃度的增加蔗糖含量逐漸增加，在2 400 μmol/L時含量最高(20.8 mg/g)，與對照相比增加了10倍(圖3-C).離體塊莖淀粉含量與糖含量的變化趨勢相反，淀粉含量在SHAM濃度為1 200 μmol/L最多(40.78 mg/g)，比對照增加了24.43%；在SHAM濃度為2 400 μmol/L時，塊莖淀粉含量最低(9.51 mg/g)，比對照減少了76.67%(圖3-D).

A：塊莖表型；B：匍匐莖結薯率；C：塊莖直徑；D：塊莖鮮質量；E：塊莖干質量.A：Tuber morphology；B：Percentage of tuberization；C：Tuber diameter；D：Tuber fresh weight；E：Tuber dry weight.圖1 不同濃度SHAM處理對馬鈴薯離體塊莖形成的影響Figure 1 Effect of SHAM on potato tuber formation in vitro

2.4 JA、SHAM和JA+SHAM處理對馬鈴薯離體塊莖形態(tài)特征的影響

單獨施加5 μmol/L JA處理匍匐莖時，匍匐莖結薯率、塊莖直徑、鮮質量和干質量均顯著增加，比對照分別增加了6.96%、26.21%、42.83%和42.53%.單獨施加2 400 μmol/L SHAM處理匍匐莖時，匍匐莖不膨大形成塊莖.5 μmol/L JA+2 400 μmol/L SHAM共同處理下，匍匐莖仍然不膨大形成塊莖.

圖2 不同濃度SHAM處理下馬鈴薯離體塊莖的LOX活性變化Figure 2 The LOX activity changes of tubers under different SHAM concentration treatment in vitro

A：葡萄糖含量；B：果糖含量；C：蔗糖含量；D：淀粉含量.A：Glucose content；B： Fructose content；C：Sucrose content；D：Starch content.圖3 不同濃度SHAM處理下馬鈴薯離體塊莖碳水化合物含量變化Figure 3 The carbohydrate content changes of tubers under different SHAM concentration treatment in vitro

2.5 JA、SHAM和JA+SHAM處理對馬鈴薯離體塊莖LOX活性的影響

由于單獨施加2 400 μmol/L SHAM和5 μmol/L JA+2 400 μmol/L SHAM共同處理匍匐莖時，匍匐莖均不膨大形成塊莖，此時測定匍匐莖中LOX活性.5 μmol/L JA單獨處理比對照LOX活性無顯著變化，2 400 μmol/L SHAM和5 μmol/L JA+2 400 μmol/L SHAM處理后，LOX活性顯著降低，比對照分別降低了87.95%和89.12%(圖5).

A：塊莖表型；B：匍匐莖結薯率；C：塊莖直徑；D：塊莖鮮質量；E：塊莖干質量.A：Tuber morphology；B：Percentage of tuberization；C：Tuber diameter；D：Tuber fresh weight；E：Tuber dry weight.圖4 JA、SHAM和JA+SHAM處理對馬鈴薯離體塊莖形成的影響Figure 4 Effect of JA,SHAM and JA+SHAM on potato tuber formation in vitro

2.6 JA、SHAM和JA+SHAM處理對馬鈴薯離體塊莖碳水化合物含量的影響

單獨施加外源5 μmol/L JA，塊莖內葡萄糖和果糖含量顯著減少，比對照分別減少了25.74%和38.41%，蔗糖含量和淀粉含量無明顯變化.由于單獨施加2 400 μmol/L SHAM和5 μmol/L JA+2 400 μmol/L SHAM共同處理匍匐莖時，匍匐莖均不膨大形成塊莖，此時測定匍匐莖中葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量.2 400 μmol/L SHAM單獨處理匍匐莖時，匍匐莖中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均顯著增加，比對照分別增加了1.6倍、0.18倍和0.47倍；匍匐莖中淀粉含量顯著降低，比對照降低了72.93%.5 μmol/L JA+2 400 μmol/L SHAM共同處理匍匐莖時，匍匐莖中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均顯著增加，比對照分別增加了177.37%、26.65%和51.13%；匍匐莖中淀粉含量顯著降低，比對照降低了73.30%(圖6).

3 討論

JA對馬鈴薯塊莖的形成和發(fā)育有重要調控作用.馬鈴薯塊莖開始形成時，JA可以促進匍匐莖頂端膨大形成塊莖，塊莖鮮質量增加[23].本研究表明，外源添加JA使塊莖體積膨大和單薯鮮質量增加.

圖5 JA、SHAM和JA+SHAM處理下馬鈴薯離體塊莖或匍匐莖中LOX活性變化Figure 5 The LOX activity changes of tubers or stolons under JA,SHAM and JA+SHAM treatment in vitro

A：葡萄糖含量；B：果糖含量；C：蔗糖含量；D：淀粉含量.A：Glucose content；B：Fructose content；C：Sucrose content；D：Starch content.圖6 JA、SHAM和JA+SHAM處理下馬鈴薯離體塊莖或匍匐莖中碳水化合物含量變化Figure 6 The carbohydrate content changes of tubers or stolons under JA,SHAM and JA+SHAM treatment in vitro

隨著SHAM濃度增加，匍匐莖膨大體積減小，塊莖鮮干質量、直徑和匍匐莖結薯率顯著降低，說明SHAM能抑制JA對塊莖形成發(fā)育的促進作用，當SHAM濃度超過2 400μmol/L時，對JA的合成抑制達不到馬鈴薯塊莖形成所需要的JA含量，導致塊莖不能正常形成；或過高濃度SHAM完全抑制了內源JA的產生后，破壞了內源JA與其他植物激素的動態(tài)平衡狀態(tài)[24].

LOX在馬鈴薯塊莖發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用.由于LOX是JA生物合成途徑中第一個重要的關鍵酶，當LOX的活性被抑制時塊莖形成受阻、塊莖體積變小以及塊莖產量減少[25].SHAM通過抑制LOX的活性，阻礙JA的生物合成，影響塊莖的形成[26].本試驗JA處理后的馬鈴薯塊莖中LOX活性顯著降低，表明外源JA的添加會負反饋于內源JA的合成，結果和LOX的活性與JA的積累成負相關的結果一致[27].當施加的合成抑制劑達到一定濃度時，LOX的活性完全被抑制，中間產物OPDA無法合成，不能產生JA及其衍生物，即使外源添加JA，也無法恢復JA的合成機制調節(jié)塊莖的生長發(fā)育；SHAM濃度達到閾值，植物激素調節(jié)的生長機制受到破壞，外源添加的JA無法運輸?shù)劫橘肭o頂端和其他激素共同調節(jié)匍匐莖膨大形成塊莖，這與前人研究發(fā)現(xiàn)的SHAM除了抑制JA的生物合成外，還會影響與其他植物激素(如生長素)的協(xié)同作用相符合[28].

JA與馬鈴薯離體塊莖中的碳水化合物的代謝有緊密的關系[29].外源JA通過促進細胞內糖的合成而控制細胞的膨大[30]，淀粉是馬鈴薯塊莖的主要成分，匍匐莖頂端開始膨大時淀粉開始積累，JA促進細胞內淀粉顆粒的增多增大，馬鈴薯塊莖膨大[31-32]，本試驗中，JA處理后馬鈴薯離體塊莖碳水化合物合成與CK相比增加，與前人研究相符合.JA能促進塊莖的形成，SHAM在一定濃度范圍內則通過調節(jié)LOX活性而抑制JA對塊莖形成的促進作用，從而導致淀粉含量的積累增加，超過一定濃度時，淀粉合成受阻，塊莖無法形成[33-34]，JA和SHAM共同處理下，塊莖淀粉含量呈現(xiàn)出先增加后降低的正態(tài)分布趨勢，與其相符合.在馬鈴薯塊莖發(fā)育過程中，普遍發(fā)生碳水化合物之間的相互轉化，糖含量發(fā)生著動態(tài)的變化，由于塊莖中糖類可以轉化為淀粉促進塊莖膨大，當還原糖含量下降時，淀粉含量增加[35-36]，本試驗中糖含量表現(xiàn)出先降低又增加的變化趨勢，這表明塊莖的發(fā)育過程中部分糖類物質可以轉化為淀粉，增加塊莖儲藏物質的積累.因此，外源添加的茉莉酸合成抑制劑達到一定濃度時，完全抑制脂氧合酶活性，茉莉酸合成機制受到破壞，即使添加外源茉莉酸，也無法調控馬鈴薯塊莖的形成.