樊梅 唐 芳 馬武開 蘭維婭

【摘 要】目的：從網(wǎng)絡藥理學角度研究桃紅四物湯治療骨質疏松癥的主要活性成分及多維藥理作用機制。方法：從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺中提取桃紅四物湯的化學成分，以口服生物利用度OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選活性成分，通過該數(shù)據(jù)庫提取活性成分作用靶點，以GeneCards和OMIM在線分析平臺挖掘靶點相關疾病，采用Cytoscape 3.7.2軟件構建活性成分?作用靶點網(wǎng)絡，String10.0構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡，最后通過基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）富集分析桃紅四物湯治療骨質疏松癥的藥理作用機制。結果：共篩選得到桃紅四物湯69個活性成分，涉及5346個作用靶點，主要涉及破骨細胞分化，激素，相關炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過程，通過調節(jié)白細胞介素-17、輔助性T細胞17、T細胞受體、Toll樣受體、雌激素、絲裂原活化蛋白激酶、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt等信號通路發(fā)揮治療骨質疏松癥的作用。結論：本研究體現(xiàn)了桃紅四物湯多成分?多靶點?多途徑的作用特點，為進一步開展桃紅四物湯治療骨質疏松癥作用機制的研究提供了新的思路與方法。

【關鍵詞】 骨質疏松癥;網(wǎng)絡藥理學;桃紅四物湯;活性成分;作用機制

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性骨骼疾病，表現(xiàn)為骨組織微結構退行性變和低骨量，引起骨的脆性和骨折的敏感性增加。各年齡段骨質疏松性骨折的發(fā)病率都在增加，女性患骨折的風險是男性的2倍。隨著我國社會進入人口老齡化階段，本病的發(fā)病率將持續(xù)升高[1]。OP主要以雙膦酸鹽類作為一線治療藥物，其次是核轉錄因子-κB受體活化因子配體（RANKL）抑制劑。甲狀旁腺素（甲狀旁腺激素的一個片段）是只有經(jīng)批準的合成代謝劑，激素替代療法（HRT）包括大量雌激素或雌激素加孕激素聯(lián)合制劑，其中一些被批準用于預防絕經(jīng)后骨折高危婦女的OP，補充鈣和維生素D經(jīng)常被認為是治療OP的輔助手段[2]。盡管這些策略對OP有很好的療效，但研究顯示長期服用這些藥物具有較大的不良反應，如對胃腸道損害、耐藥等。因此，尋求一種安全有效治療OP的藥物具有重要的臨床意義[3]。

OP屬中醫(yī)學“骨痿”“虛勞”“骨痹”“骨枯”等范疇。許多中草藥及經(jīng)典古方在辨證論治基礎上治療OP得到了良好的應用，在臨床上取得了較好的療效[4]。桃紅四物湯最早出自清·吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》，是由四物湯加桃仁、紅花而成，也稱加味四物湯，全方有活血化瘀、養(yǎng)血補血的作用，是治療血瘀證的常用方。四物湯中當歸、川芎為血中之氣藥，熟地黃、白芍為血中之血藥，加上桃仁、紅花的活血作用，全方具有養(yǎng)血而不滯血、活血而不傷血的功效[5]。楊國柱等[6]利用潑尼松誘導斑馬魚OP模型評價桃紅四物湯抗OP作用的實驗研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯對斑馬魚OP模型有明顯的治療作用。此外，很多研究都表明，桃紅四物湯具有治療OP的作用，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療OP具有很大的優(yōu)勢及潛力。桃紅四物湯在中醫(yī)藥治療OP的臨床實踐中雖得到廣泛的運用，但其藥效物質基礎及具體作用機制尚不清楚，這是限制其臨床廣泛運用的關鍵問題。因此，基于桃紅四物湯所含有效成分的復雜性、多樣性，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探討桃紅四物湯對OP的藥理作用機制，并基于藥物、靶點和OP靶點之間的關系建立藥理學網(wǎng)絡，希望能為深入了解桃紅四物湯治療OP提供一定的參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 桃紅四物湯所含化合物的收集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）收集桃紅四物湯中桃仁、紅花、當歸、川芎、白芍、熟地黃6味藥的成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為限定條件對所收集到的化合物進行篩選。

1.2 桃紅四物湯所含化合物作用靶點的預測 對1.1中化合物的作用靶點進行預測。

1.3 OP發(fā)病靶點檢索及桃紅四物湯作用OP相關靶點的預測 通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將所得藥物靶點ID轉換成GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）的基因名稱。以“osteoporosis”作為關鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫收集與OP相關的基因，取得分≥0.4的靶點，將挖掘得到的OP相關基因與桃紅四物湯靶點基因互相映射篩選出共同靶點，獲得桃紅四物湯治療OP的作用靶點。

1.4 桃紅四物湯所含化合物作用OP相關靶點相互作用的網(wǎng)絡構建 將每個化合物與其作用的OP靶點相聯(lián)系，通過Cytoscape 3.7.2軟件進行桃紅四物湯的成分-OP相關靶點相互作用網(wǎng)絡的構建并繪制網(wǎng)絡圖，利用軟件中的Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡節(jié)點度和介數(shù)中心度。

1.5 桃紅四物湯對OP作用靶點的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建 為了說明靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將桃紅四物湯相關靶點基因上傳至在線String10.0軟件（https：//string-db.org/），選擇研究物種為人類，設置靶點之間最低要求聯(lián)系分數(shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點聯(lián)系的靶點，構建由導入基因表達產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡，并且利用R語言3.6.1軟件（https：//www.r-project.org/）對PPI網(wǎng)絡中的蛋白繪制條形圖。

1.6 桃紅四物湯治療OP預測靶點富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫，以P < 0.05作為篩選條件獲得靶點蛋白進行基因本體（GO）功能富集分析及基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，包括生物過程、細胞組成和分子功能3個部分。

2 結 果

2.1 活性化合物的篩選 為了提供更準確的結果，本研究挑選TCMSP中OB≥30%、DL≥0.18的化合物，共檢索出730個化合物，其中桃仁66個、紅花189個、當歸125個、川芎189個、白芍85個、熟地黃76個，通過篩選得出69個活性化合物，如谷甾醇α1、β-胡蘿卜素、黃芩苷、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、槲皮素、豆甾醇、芍藥總黃酮、芍藥苷、兒茶素等。

2.2 桃紅四物湯所含化合物作用靶點的預測 對2.1中化合物的作用靶點進行預測，共得到5346個作用靶點。

2.3 桃紅四物湯靶點與OP靶點相互作用韋恩圖 依據(jù)Relevance score≥4標準，按分子-靶蛋白對接結果篩選出相關靶蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫轉換成對應的基因名稱，如遇PBD ID對應多個基因，則核對靶蛋白內(nèi)容選擇基因，確保1個蛋白對應1個基因。結果，共得到199個靶基因，再依據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫挖掘得到OP相關基因615個，最后將桃紅四物湯活性成分-OP靶點相關基因映射，共發(fā)現(xiàn)41個共同基因，確定為桃紅四物湯治療OP的靶基因。見圖1。

2.4 桃紅四物湯靶點-OP相互作用網(wǎng)絡 將候選化學成分與OP靶點通過Cytoscape 3.7.2建立桃紅四物湯成分靶點-OP靶點群網(wǎng)絡，得出桃紅四物湯靶點-OP網(wǎng)絡主要由56個節(jié)點（13個化合物節(jié)點，43個靶點節(jié)點）和115條邊組成，其中菱形節(jié)點紅色表示疾病OP，六邊形紫色表示藥物，黃色三角形節(jié)點表示桃紅四物湯藥物活性成分，圓形綠色節(jié)點表示桃紅四物湯可能是通過這些基因治療OP，連接化合物與靶點的每條邊表示桃紅四物湯活性成分與OP靶點之間的相互作用關系。見圖2。在桃紅四物湯靶點-OP靶點網(wǎng)絡中，桃紅四物湯中有13種主要成分作用于OP相關靶點，充分體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。其主要的化合物有β-谷甾醇、木脂素、6-羥基山奈酚、黃芩素、槲皮素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍藥苷、兒茶素、肉豆蔻堿等，這些藥物的活性成分可能是治療OP的物質基礎。

2.5 靶點PPI網(wǎng)絡、關鍵基因分析 PPI網(wǎng)絡包含41個靶蛋白節(jié)點，共有403條相互作用連線。見圖3。其中度值較大的有白細胞介素（IL）-6（度值 = 38）、IL-B（度值 = 35）、JUN（度值 = 32）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9，度值 = 30）、表皮生長因子（EGF，度值 = 28）、低聚果糖（FOS，度值 = 28）等，它們與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡中發(fā)揮了關鍵作用。見圖4。

2.6 GO生物過程分析 將41個靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO生物過程富集，根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR） < 0.05篩選出62個GO生物過程。其中受體調節(jié)活性、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、受體配體活性、染色質結合活性等位于GO生物過程富集的前面。見圖5、圖6。OP的發(fā)生、發(fā)展涉及蛋白質的活性、轉錄因子的活性、DNA及RNA的轉錄調節(jié)等生物過程，而桃紅四物湯可通過調節(jié)以上生物過程治療OP。

2.7 KEGG信號通路分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫將桃紅四物湯的41個靶基因在KEGG信號通路中富集，根據(jù)FDR < 0.05篩選出與OP密切相關的信號通路，包括IL-17、輔助性T細胞17（Th17）細胞、T細胞受體、Toll樣受體、雌激素、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt等信號通路。其中每條通路都有相對應的通路圖，涉及破骨細胞分化，激素，相關炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過程。由此推測，桃紅四物湯可能主要通過調節(jié)以上關鍵基因，影響此類信號通路發(fā)揮治療OP的作用。KEGG富集通路的柱狀圖，見圖7。

3 討 論

OP是一種以骨量減少、骨的微觀結構破壞為主要特征的全身性疾病，臨床上以全身骨痛及易于發(fā)生骨折為主要表現(xiàn)，尤以老年人及絕經(jīng)后婦女多見，隨著我國人口老齡化加快，其分型又以絕經(jīng)后OP為常見[7-8]。季兆潔等[9]發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯具有顯著的促進骨折愈合作用，促進骨痂微血管的新生，顯示出良好的祛瘀生新作用。中醫(yī)藥治療OP具有價格低廉、劑型豐富、不良反應小、依從性好等優(yōu)勢，在治療早中期OP方面發(fā)揮著不可替代的作用[10]。而網(wǎng)絡藥理學通過對中藥的收集整合，建立了多種中藥數(shù)據(jù)庫，以可視化的形式將各個藥物與疾病之間的關系系統(tǒng)地呈現(xiàn)出來[11]。從本研究結果來看，桃紅四物湯中關鍵的活性成分、基因參與并調控了OP的進程，與目前已有的關于桃紅四物湯治療OP的研究相一致，為桃紅四物湯“多成分—多靶點—多疾病”治療OP的機制提供了參考。

從OP與桃紅四物湯的共同靶點來看，OP與桃紅四物湯相關的活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡中包含41個靶點，其中度值較大的有IL-6、IL-B、JUN、MMP-9、EGF、FOS等，推測桃紅四物湯有效成分可能通過抑制上述靶點發(fā)揮作用。如血清IL-6可能與OP的發(fā)病有關[12]，MMP-9是破骨細胞前體的重要調節(jié)因子[13]。

本研究初步篩選出桃紅四物湯治療OP的活性成分有β-谷甾醇、木脂素、6-羥基山奈酚、黃芩素、槲皮素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍藥苷、兒茶素、肉豆蔻堿等。β-谷甾醇是一種植物甾醇，在體外和體內(nèi)研究中被報道為具有抗炎、抗血管生成和降低膽固醇作用;槲皮素為一種黃酮類化合物，據(jù)報道，槲皮素可以降低因小鼠卵巢切除和骨修復而導致的骨完整性喪失。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種藥物具有改善骨脆性和骨折的藥理作用，能逆轉體內(nèi)外雌激素調節(jié)引起的骨重塑的衰弱狀態(tài)，維持鈣、磷水平和骨完整性[14]。有研究者利用代謝組學的方法，評價木脂素對去卵巢OP模型大鼠的療效和治療靶點，最終鑒定出16種潛在的生物標志物，通過影響內(nèi)源性相關代謝機制，為絕經(jīng)后OP的治療提供了藥理依據(jù)[15]。付方勝等[16]實驗提示，黃芩素可以通過抑制RANKL誘導的破骨細胞分化和骨吸收功能，預防破骨細胞增強導致的OP;此外，它還可通過激活mTORC1信號通路刺激MC3T3-E1細胞分化為成骨細胞[17]。

山奈酚是一種天然黃酮類化合物，從山奈酚根狀莖中提取，研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚對去卵巢大鼠OP的防治作用是使骨密度有顯著提高，明顯抑制大鼠尿液中骨鈣和磷的流失，能夠顯著抑制去卵巢大鼠血清中酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K的活性，改善OP大鼠骨小梁形態(tài)結構[18-19]。β-胡蘿卜素能促進成骨細胞的早期分化，維持骨轉換的正平衡[20]。木犀草素是一種具有抗氧化活性的植物類黃酮。研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過減輕氧化應激促進成骨細胞增殖，并通過調節(jié)ERK/LRP-5/GSK-3β途徑促進成骨細胞分化，在糖皮質激素性OP的治療中發(fā)揮重要作用[21]。芍藥苷是一種天然產(chǎn)物，能提高成骨細胞活性，抑制破骨細胞活性，從而減少去卵巢引起的OP[22]。綜上所述，桃紅四物湯的有效成分之間不僅存在緊密的協(xié)同關系，而且其作用靶點也在整個疾病進程中發(fā)揮著重要作用。

從通路富集結果分析可知，桃紅四物湯治療OP核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17、Th17細胞、T細胞受體、Toll樣受體、雌激素、MAPK、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt、AGE-RAGE等。其中每條通路都有相對應的通路圖，涉及破骨細胞分化，激素，相關炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過程。

根據(jù)本研究結果，桃紅四物湯多靶點、多通路治療OP的機制得到初步驗證，網(wǎng)絡藥理學分析結果從另一方面也說明了引起OP因素多且復雜，為從分子水平方向進一步揭示桃紅四物湯治療OP的潛在化學成分及作用機制，為后期藥物研發(fā)及疾病治療提供一定的理論依據(jù)。

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收稿日期：2020-02-29;修回日期：2020-04-16