王家敏，王美皓，馬玉梅，靳冬武，趙彩紅，李自良，喬自林，馬忠仁

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010)

轉(zhuǎn)染是指真核細(xì)胞接收外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程.該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因的結(jié)構(gòu)和功能分析、基因表達(dá)與調(diào)控、基因治療與轉(zhuǎn)基因動物等研究[1,2].目前通常使用的方法有電擊轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染和磷酸鈣沉淀法.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法因其操作簡便、結(jié)果可靠、可攜帶大片段DNA、可重復(fù)性強(qiáng)和安全性好等而被廣泛采用，但不足之處是轉(zhuǎn)染效率較低[3].因此，如何做到無害且高效地將目的基因?qū)氚屑?xì)胞是脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的關(guān)鍵.MDCK細(xì)胞是目前公認(rèn)的替代雞胚生產(chǎn)流感疫苗的傳代細(xì)胞系之一，但該細(xì)胞系的致瘤性問題一直備受關(guān)注.對于致瘤機(jī)理研究必將是今后的研究重點(diǎn)，MDCK細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染將是必不可少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[4,5].本研究探究了脂質(zhì)體介導(dǎo)的MDCK細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率，并優(yōu)化獲得了較佳的轉(zhuǎn)染方案，以期為MDCK細(xì)胞開展基因操作提供一定的理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

貼壁培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞從ATCC引進(jìn)，引進(jìn)后由甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心按《中國藥典》2010版的要求建立主細(xì)胞庫(MDCK-M-60，P60)和工作細(xì)胞庫(MDCK-W-63，P63).

1.1.2 培養(yǎng)基及血清

DEME(high-glucous，蘭州百靈生物)；Opti-MEM?Medium(Gibco)；胎牛血清(批號：20150715，蘭州民海生物).

1.1.3 基因轉(zhuǎn)染試劑

p-EGFP-C1質(zhì)粒(甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心保存提供)；Lipofectamine?2000 Reagent(11668-030, Invitrogen).

1.1.4 主要試劑及儀器

0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物)、0.2%臺盼藍(lán)(Sigma)、PBS(蘭州百靈生物)、T25方瓶(Corning)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)、倒置熒光顯微鏡(Olympus,CKX-41)、CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher, 3111型)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar, IC1000)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)等.

1.2 方法

1.2.1 MDCK細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

根據(jù)慢凍快融的原則[6]，復(fù)蘇MDCK-W-63工作庫細(xì)胞1支，加至10 mL含10%(V/V)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5.0% CO2)培養(yǎng).次日觀察，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng).待細(xì)胞長成致密單層后，常規(guī)方法消化，按照2×104/cm2的密度接種MDCK細(xì)胞至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5.0% CO2)培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn).

1.2.2 MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化

挑選MDCK細(xì)胞匯合度達(dá)到90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染前，按照表1的配比將質(zhì)粒和脂質(zhì)體分別用Opti-MEM?培養(yǎng)液稀釋至125 μL，并充分混勻，室溫孵育5 min.棄細(xì)胞舊培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，將質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物分別逐滴加入，每個配比濃度設(shè)置4個復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5.0% CO2)中培養(yǎng)，6 h后換成DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)[3].

表1 MDCK細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與脂質(zhì)體(μg∶μL)配比表

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測

取轉(zhuǎn)染后36 h的MDCK細(xì)胞，于倒置熒光顯微鏡下觀察MDCK細(xì)胞中增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表達(dá)情況，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，800 rpm離心5 min，棄上清液，加入2 mL PBS重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率.將細(xì)胞懸液與0.2%臺盼藍(lán)溶液以1∶1的比例混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞活率[7].

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

樣本用x±s表示，使用SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義.

2 結(jié)果分析

2.1 MDCK細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與觀察

復(fù)蘇的MDCK細(xì)胞貼壁后狀態(tài)良好，形態(tài)呈扁平狀，多呈不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核.按照2×104/cm2的密度接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞狀態(tài)較好，達(dá)到90%的匯合度，見圖1.

圖1 MDCK細(xì)胞生長狀態(tài)

2.2 MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析

本研究按照質(zhì)粒濃度設(shè)置三大組，分別為0.2 μg、0.5 μg、0.8 μg，又按照質(zhì)粒(μg)和脂質(zhì)體(μL)的比例設(shè)置五大組，分別為1∶1、1∶ 1.5、1∶ 2、1∶ 2.5、1∶ 3 ，并設(shè)置陰性對照組，共16組實(shí)驗(yàn).詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、表3.

表2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞活率和轉(zhuǎn)染效率比較

表3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析圖譜

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后MDCK細(xì)胞，15個實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活率與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的質(zhì)粒于脂質(zhì)體濃度轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞對細(xì)胞活力無明顯影響.

另外，設(shè)置的三大組質(zhì)粒濃度下，質(zhì)粒(μg)∶脂質(zhì)體(μL)五個比例濃度中，均發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染率∶質(zhì)粒濃度0.5 μg高于0.8 μg高于0.2 μg，且差異顯著(P<0.05)，因此MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染最佳質(zhì)粒濃度為0.5 μg.在質(zhì)粒濃度為0.5 μg實(shí)驗(yàn)大組，隨著脂質(zhì)體濃度的增加MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染率逐漸增加，當(dāng)質(zhì)粒(μg)∶脂質(zhì)體(μL)濃度為0.5∶ 1.0、0.5∶1.25、0.5∶ 1.5時，轉(zhuǎn)染率達(dá)到了較高水平，分別為(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%.因此，從經(jīng)濟(jì)因素來考慮，脂質(zhì)體介導(dǎo)的MDCK細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(μg)與脂質(zhì)體(μL)的最佳配比濃度為0.5∶ 1.0.

3 討論

脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染是研究目的基因生物學(xué)特性不可缺少的實(shí)驗(yàn)操作，而高效的基因轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作成功的關(guān)鍵[8].一般為了獲得高效的表達(dá)效率，在轉(zhuǎn)染不同目的基因和應(yīng)用不同受體細(xì)胞時均需要進(jìn)行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的摸索.目的基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率的檢測方法有多種，常用的方法有實(shí)時熒光定量PCR和免疫熒光等，分別從mRNA和蛋白水平檢測，還可以通過相應(yīng)的功能實(shí)驗(yàn)檢測[9].但上述方法均較為費(fèi)時費(fèi)力，如何獲知優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件，以便獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和較高的目的基因表達(dá)情況，進(jìn)而為后續(xù)目的基因的生物學(xué)活性研究奠定基礎(chǔ)成為轉(zhuǎn)染的重點(diǎn)和難點(diǎn)[10].