安建科，鄭 喆，王 倩，董繼剛，馮君平，喻大鑫，馬國(guó)榮，杜送田

(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730046)

在大多數(shù)國(guó)家，腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，腦膜炎雙球菌)都已被確認(rèn)為導(dǎo)致腦膜炎和爆發(fā)性敗血癥的首要原因，并且已構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1].絕大多數(shù)侵襲性腦膜炎球菌感染由表達(dá) A、 B、 C、 X、 W135 或 Y 群莢膜多糖的血清群引發(fā)[2].接種腦膜炎球菌多糖疫苗或者結(jié)合疫苗是預(yù)防腦膜炎球菌性腦膜炎的有效手段.為方便研究和制備A、C、Y、W135群四價(jià)多糖疫苗和結(jié)合疫苗，本文詳細(xì)考察了A群腦膜炎球菌發(fā)酵過(guò)程中的溶氧(DO)、pH值、培養(yǎng)溫度、接種濃度、葡萄糖補(bǔ)料等條件的影響，使A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量有了較大的提高.

1 材料與方法

1.1 菌種

A群腦膜炎球菌CMCC29201(A4) 株來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院.

1.2 培養(yǎng)基

10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣州市迪景微生物科技有限公司、腦膜炎球菌液體培養(yǎng)基為本公司培養(yǎng)基室配制，其主要成分為酪蛋白酸水解物(AN1.2 mg/mL)、酵母透析液(0.5%)、磷酸二氫鉀(0.02%)、磷酸氫二鈉(0.1%)、氯化銨(0.125%)、甘氨酸(0.01%)、L-谷氨酸鈉(0.1%)、硫酸鎂(0.06%)、葡萄糖(0.5%或1.0%)、酵母浸出粉(0.1%).

1.3 儀器

30 L 發(fā)酵罐購(gòu)自成都英德，722G可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司，血糖儀購(gòu)自羅氏，冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自Hettich公司，細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中檢院.

1.4 菌種傳代及培養(yǎng)

菌種開(kāi)啟后，接種于10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上，于35～37 ℃燭缸培養(yǎng)12～20 h后，接種于搖瓶(培養(yǎng)基量2 000 mL，葡萄糖含量0.5%)，發(fā)酵8～12 h后，轉(zhuǎn)種于30 L 發(fā)酵罐(培養(yǎng)基裝量15 L，葡萄糖含量1.0%).維持pH 6.8～7.2，通氣5～30 L/min,培養(yǎng)6～10 h，待pH回升超過(guò)設(shè)定值0.05,即加入終濃度2.5%甲醛溶液殺菌.取1.5 mL發(fā)酵液于6 000 g、8 ℃離心 10 min去沉淀，1 mL上清液中加入10 μL的10% CTAB，混勻放置10 min后于8 000 g、8 ℃離心5 min棄去上清，沉淀加入1 mol/L氯化鈣溶液0.25 mL使其溶解，然后加入0.75 mL注射用水混勻，再用注射用水稀釋至磷含量4～20 μg/mL[3]后按中國(guó)藥典2015版通則3103測(cè)定磷含量，A群多糖含量=磷含量×稀釋倍數(shù)÷0.75.

1.4.1 溶氧(DO)對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

設(shè)定pH為7.0、溫度為36 ℃、接種后終濃度為5 億/mL、培養(yǎng)過(guò)程不補(bǔ)加葡萄糖，通過(guò)通氣攪拌聯(lián)動(dòng)控制溶氧在5%、10%和20%.不同溶氧值培養(yǎng)重復(fù)三批，通過(guò)測(cè)定A600值考察溶氧對(duì)A群腦膜炎球菌菌體生長(zhǎng)情況的影響，通過(guò)測(cè)定殺菌發(fā)酵液的磷含量考察溶氧對(duì)A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量的影響.

1.4.2 pH 值對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

設(shè)定溶氧為10%、溫度為36 ℃、接種后終濃度為5 億/mL、培養(yǎng)過(guò)程不補(bǔ)加葡萄糖，通過(guò)自動(dòng)補(bǔ)加10%氫氧化鈉溶液控制pH在6.6、7.0和7.4，不同pH值培養(yǎng)重復(fù)三批.通過(guò)測(cè)定A600值考察pH對(duì)A群腦膜炎球菌菌體生長(zhǎng)情況的影響，測(cè)定殺菌發(fā)酵液的磷含量來(lái)考察pH對(duì)A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量的影響.

1.4.3 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

設(shè)定溶氧為10%、pH為7.0、接種后終濃度為5 億/mL,培養(yǎng)過(guò)程不補(bǔ)加葡萄糖，控制培養(yǎng)溫度為34±0.5 ℃、36±0.5 ℃和38±0.5 ℃，不同溫度培養(yǎng)重復(fù)三批，通過(guò)測(cè)定A600值考察溫度對(duì)A群腦膜炎球菌菌體生長(zhǎng)情況的影響，通過(guò)測(cè)定殺菌發(fā)酵液的磷含量考察溫度對(duì)A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量的影響.

1.4.4 接種終濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

設(shè)定溶氧為10%、pH為7.0、溫度為36 ℃,培養(yǎng)過(guò)程不補(bǔ)加葡萄糖，控制接種后終濃度為2.5 億/mL、5 億/mL、7.5 億/mL，不同接種終濃度培養(yǎng)重復(fù)三批.通過(guò)測(cè)定A600值考察接種終濃度對(duì)A群腦膜炎球菌菌體生長(zhǎng)情況的影響，通過(guò)測(cè)定殺菌發(fā)酵液的磷含量考察接種終濃度對(duì)A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量的影響.

1.4.5 葡萄糖補(bǔ)料對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

設(shè)定溶氧為10%、pH為7.0、溫度為36 ℃,接種終濃度為5 億/mL，分別采用4小時(shí)一次性補(bǔ)入終濃度10 mmol/L葡萄糖、4 h開(kāi)始每半小時(shí)分別補(bǔ)入終濃度2 mmol/L葡萄糖,4 h開(kāi)始采用固定速率持續(xù)補(bǔ)糖三種葡萄糖補(bǔ)料方式，不同葡萄糖補(bǔ)料方式培養(yǎng)重復(fù)三批.通過(guò)測(cè)定殺菌發(fā)酵液的磷含量考察葡萄糖補(bǔ)料方式對(duì)A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量的影響.

2 結(jié)果

圖1 DO對(duì)A群腦膜炎球菌(A)細(xì)菌生長(zhǎng)和(B)莢膜多糖產(chǎn)量的影響

2.1 DO對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

在DO為5%的條件下，A群腦膜炎球菌生長(zhǎng)較慢，發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，7小時(shí)后最終OD值也僅為6.65，DO為10%和20%時(shí)生長(zhǎng)較快.6小時(shí)OD均超過(guò)11，兩者生長(zhǎng)趨勢(shì)差異不大，見(jiàn)圖1.從多糖產(chǎn)量來(lái)看，DO為5%時(shí)，多糖產(chǎn)量約為120 mg/L發(fā)酵液；DO為10%和20%時(shí)，多糖產(chǎn)量分別約為260和280 mg/L 發(fā)酵液.表明DO超過(guò)10%后，對(duì)多糖產(chǎn)量無(wú)明顯影響.

2.2 pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

當(dāng)pH值控制在6.6～7.4范圍內(nèi)時(shí)，pH較高則A 群腦膜炎球菌生長(zhǎng)較快，見(jiàn)圖2.但A 群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量隨著pH升高而下降，多糖產(chǎn)量依次為278 、260和233 mg/L發(fā)酵液，綜合考慮選擇pH7.0較為適宜.

圖2 pH對(duì)A群腦膜炎球菌(A)細(xì)菌生長(zhǎng)和(B)莢膜多糖產(chǎn)量的影響

2.3 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

溫度在36 ℃和38 ℃時(shí)，A群腦膜炎球菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)比較接近，38 ℃時(shí)略快，而34 ℃時(shí)生長(zhǎng)相對(duì)較慢一些，但最終OD值接近，見(jiàn)圖3.在34 ℃時(shí)，A 群腦膜炎球菌多糖產(chǎn)量為276 mg/L 發(fā)酵液，而36 ℃和38 ℃時(shí)多糖產(chǎn)量分別為260 mg/L和249 mg/L發(fā)酵液.表明在36 ℃到38 ℃溫度范圍內(nèi)溫度越高菌體的生長(zhǎng)速度更快，而多糖產(chǎn)量略微下降，綜合考慮選擇36 ℃為最佳培養(yǎng)溫度.

圖3 溫度對(duì)A群腦膜炎球菌(a)細(xì)菌生長(zhǎng)和(b)莢膜多糖產(chǎn)量的影響

2.4 接種終濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，接種終濃度對(duì)A 群腦膜炎球菌生長(zhǎng)和多糖的產(chǎn)量均有較大的影響，見(jiàn)圖4.接種終濃度為2.5 億/mL，生長(zhǎng)時(shí)間為7 h，多糖的產(chǎn)量?jī)H約為133 mg/L發(fā)酵液，而接種終濃度為5 億，生長(zhǎng)時(shí)間為6 h，多糖產(chǎn)量提高了近1 倍，約為260 mg /L 發(fā)酵液.接種終濃度為7.5 億/mL，生長(zhǎng)時(shí)間為5 h，但多糖含量降為217 mg/L 發(fā)酵液左右，表明接種終濃度越大，生長(zhǎng)速度越快，但多糖產(chǎn)量的提高需要選擇合適的接種終濃度.

圖4 接種終濃度對(duì)A群腦膜炎球菌(A)細(xì)菌生長(zhǎng)和(B)莢膜多糖產(chǎn)量的影響

2.5 葡萄糖補(bǔ)料對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響

A群腦膜炎球菌發(fā)酵過(guò)程中不補(bǔ)加葡萄糖時(shí)，發(fā)酵液中葡萄糖下降趨勢(shì)見(jiàn)圖5.葡萄糖的補(bǔ)料對(duì)多糖的產(chǎn)量有較大影響，不補(bǔ)加葡萄糖，多糖的產(chǎn)量?jī)H約為260 mg/L發(fā)酵液，而補(bǔ)加葡萄糖，多糖產(chǎn)量提高到346 mg/L 發(fā)酵液.補(bǔ)料方式的不同，多糖產(chǎn)量也不同.4小時(shí)一次性補(bǔ)入終濃度10 mmol/L葡萄糖，多糖的產(chǎn)量提高為283 mg/L發(fā)酵液，4 h開(kāi)始每半小時(shí)分別補(bǔ)入終濃度2 mmol/L葡萄糖，則多糖產(chǎn)量提高到327 mg/L發(fā)酵液，而4 h開(kāi)始采用固定速率持續(xù)補(bǔ)糖，則多糖產(chǎn)量達(dá)到346 mg/L 發(fā)酵液，表明采用固定速率持續(xù)補(bǔ)糖有利于多糖的合成，見(jiàn)圖6.

圖5不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖的含量變化 圖6葡萄糖補(bǔ)料方式對(duì)A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量的影響

3 討論

腦膜炎球菌在發(fā)酵罐中采用深層通氣培養(yǎng)，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境和條件,如pH、溫度、溶氧、接種量以及培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖的補(bǔ)給方式等有利于菌體的生長(zhǎng)發(fā)育,也有利于莢膜多糖的分泌與形成[4].

5%的溶氧設(shè)定明顯過(guò)低，抑制了A群腦膜炎球菌細(xì)菌的生長(zhǎng).由于多糖伴隨著菌體生長(zhǎng)而合成，菌體生長(zhǎng)過(guò)慢會(huì)影響多糖的合成，因此多糖產(chǎn)量也顯著降低.當(dāng)溶氧條件在10%和20%時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)和多糖產(chǎn)量非常接近.在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，我們將溶氧控制在10%.菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成都是酶反應(yīng)的結(jié)果，pH值和培養(yǎng)溫度會(huì)影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，影響細(xì)菌的代謝調(diào)控機(jī)制及發(fā)酵液的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生物合成[5].高的pH值和溫度有利于A(yíng)群腦膜炎球菌的生長(zhǎng)，而低的pH值和溫度更有利于多糖合成.綜合考慮，我們選擇pH7.0和培養(yǎng)溫度36 ℃的中間值.菌種接種終濃度太高,細(xì)菌過(guò)早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)菌生長(zhǎng)濃度高,但產(chǎn)糖量卻并沒(méi)有提高，菌種接種終濃度太低,則細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢,也不利于多糖產(chǎn)量[6].因此A群腦膜炎球菌接種終濃度以5億/mL為佳.細(xì)菌莢膜多糖合成在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與細(xì)菌濃度正相關(guān)，而之后細(xì)菌濃度不再增加，而多糖合成則仍在繼續(xù)[7].A群腦膜炎球菌生長(zhǎng)過(guò)程中最主要的碳源為葡萄糖,補(bǔ)加葡萄糖可以延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以被綜合利用，使細(xì)菌產(chǎn)生莢膜多糖的時(shí)間增加，提高多糖的產(chǎn)量[8].而葡萄糖的補(bǔ)加方式對(duì)多糖產(chǎn)量影響也非常明顯，采用固定速率補(bǔ)糖，速率既可以維持發(fā)酵液液中的葡萄糖含量，又可以避免葡萄糖阻遏效應(yīng)[9]，可以大幅提高多糖的產(chǎn)量.

通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，A群多糖產(chǎn)量可以達(dá)到346 mg/L 發(fā)酵液以上.