耿金靜,魏鎖成

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

牛腹瀉性疾病是造成30日齡以下的犢牛生長(zhǎng)發(fā)育不良和死亡的主要原因，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2].研究表明，引起犢牛腹瀉的原因很多，主要包括飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)、天氣變化及生物制劑使用等非傳染性致病因素和細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲(chóng)等傳染性致病因素.近年來(lái)，隨著病原診斷技術(shù)的發(fā)展，證明犢牛的傳染性腹瀉主要由病毒引起[1-3].本文對(duì)引起牛病毒性腹瀉的主要病毒和診斷技術(shù)領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為牛腹瀉病的診斷、疫苗研發(fā)和有效治療提供參考.

1 牛病病毒性腹瀉的主要致病病毒

1.1 牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)由Bishop等于1973年發(fā)現(xiàn)，屬呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，其大小為60～80 nm，無(wú)包膜和多層核衣殼的RNA病毒[4]，有3種重要的抗原特異性：組、亞組和血清型[2].RV根據(jù)內(nèi)層衣殼蛋白(VP-6)的組特異性抗原表位可分為A～G 7個(gè)組.A組RV根據(jù)VP6的亞組特異性抗原表位又可分為2個(gè)亞組或血清群.A組RV根據(jù)外層衣殼蛋白VP4和VP7可分為不同的血清型.根據(jù)VP7可至少分為27個(gè)G血清型，根據(jù)VP4則可分為35個(gè)以上的P血清型.A組輪狀病毒是犢牛的主要病原體，B組次之.A組輪狀病毒為dsRNA，由11個(gè)片段組成，位于病毒粒子的衣殼內(nèi).RV基因序列中富含A和T，A+T比值達(dá)58%～67%，每個(gè)基因片段5′-末端有一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，其后為5′-末端保守序列，之后緊接閱讀框，編碼一種蛋白產(chǎn)物.終止密碼之后為3′-末端保守序列.5′-末端和3′-末端序列高度保守[2,4].

RV的11個(gè)基因分別編碼11種蛋白質(zhì)，其中包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～3、VP4、VP6和VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～5).VP4是病毒結(jié)合宿主細(xì)胞受體的病毒蛋白，直接決定了病毒的毒力，同時(shí)也限制了一些RV在組織細(xì)胞中的生長(zhǎng).RV的VP6位于病毒三層核衣殼的中層，是維持病毒顆粒穩(wěn)定的主要結(jié)構(gòu)蛋白.VP6與NSP4相互作用介導(dǎo)VP4和VP7進(jìn)入病毒顆粒，VP6含有的一個(gè)CTL細(xì)胞表位可能使VP6在保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用.VP7是一種糖基化蛋白，構(gòu)成病毒三層衣殼的最外光滑層，含量高、抗原性強(qiáng)，是RV的主要保護(hù)性抗原.NSP4是最受重視的非結(jié)構(gòu)蛋白，是非常保守的蛋白質(zhì).不同株RV的NSP4的同源性為87.3%～96.6%.RV的NSP4具有腸毒素樣功能，感染細(xì)胞破裂釋放病毒時(shí)，NSP4被釋放并作用于鄰近的腸黏膜細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，促使Cl-分泌，從而引起腹瀉[4].

BRV是一種廣泛存在的病毒，其中A 群輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的主要病原.BRV在犢牛小腸絨毛的上皮細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，破壞絨毛中成熟的腸細(xì)胞，受損細(xì)胞的血管活性成分使腸神經(jīng)系統(tǒng)活化，進(jìn)而促進(jìn)病毒腸毒素(例如NSP4)的分泌，引起1～2周齡犢牛消化不良或吸收不良的腹瀉[5].Komoto S等通過(guò)研究A群RV的G8P[1]發(fā)現(xiàn),RV在人和動(dòng)物之間是通過(guò)直接傳播的方式傳播的[6].牛輪狀病毒腹瀉是一種急性疾病，死亡率高，潛伏期很短，為12～24小時(shí)，有時(shí)為18～96小時(shí).感染后的犢牛表現(xiàn)為腹瀉、脫水、食欲不振、不愿飲水和移動(dòng)，糞便呈淡黃色，無(wú)血，且伴有大量粘液，腹瀉通常持續(xù)4～8天，BRV主要存在于新生犢牛中，3月齡以上的牛不易感染[2].

1.2 牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)屬于冠狀病毒科乙型冠狀病毒屬2a亞群，是一種有包膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，由美國(guó)Mebus等人首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道，主要參與牛的腸道感染和呼吸道疾病.根據(jù)BCoV的病原分離來(lái)源不同可分為BRCoV(呼吸道來(lái)源)和BECoV(腸道來(lái)源).BECoV又可細(xì)分為BCoV-CD(犢牛腹瀉)和BCoV-WD(成年牛冬痢)[7].

BCoV的基因組包括13個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORFs)，兩側(cè)有5′-UTR和3′-UTR區(qū)域.BCoV基因組由5種結(jié)構(gòu)蛋白和16種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1～16)組成.基因組RNA內(nèi)編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白有ORF3內(nèi)的血凝素酯酶蛋白(HE)、ORF4內(nèi)的纖突蛋白(S)、ORF4內(nèi)的小膜蛋白(E)、ORF9內(nèi)的跨膜蛋白(M)、ORF10內(nèi)的核衣殼蛋白(N).S蛋白是病毒表面的1型病毒融合蛋白，長(zhǎng)度為4 038 bp，在誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生方面起重要作用.S蛋白在氨基酸的768-769處可裂解成兩個(gè)亞基：S1亞基和S2亞基.S1亞基的下游高變區(qū)(HVR)在每個(gè)毒株中不同，可使病毒結(jié)合在宿主細(xì)胞受體上；S2亞基在毒株中是保守的，可使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜結(jié)合[8-9].N蛋白是BCoV的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，與基因組 RNA 組裝成核糖核蛋白復(fù)合物，在病毒致病性、轉(zhuǎn)錄、翻譯、增強(qiáng)免疫力及輔助增強(qiáng)病毒RNA復(fù)制方面起重要作用，其基因高度保守，可作為診斷BCoV的候選基因[9].HE蛋白在病毒進(jìn)入和感染宿主細(xì)胞后釋放過(guò)程起重要作用[6].

BCoV是引起犢牛腹瀉的重要病原.BCoV的S蛋白和HE蛋白結(jié)合并附著在腸上皮細(xì)胞，病毒在腸細(xì)胞中復(fù)制，損傷腸絨毛上皮細(xì)胞.BCoV也可感染隱窩腸細(xì)胞，使小腸和結(jié)腸隱窩的絨毛萎縮，固有層壞死，可引起1周至3個(gè)月齡的新生牛犢出現(xiàn)水樣腹瀉，成年牛冬痢，呈出血性腸炎，并伴有厭食癥、脫水、消瘦等癥狀.此外，BCoV感染是造成全球乳品行業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因.BCoV輕度流行，產(chǎn)奶量降幅10%左右，持續(xù)時(shí)間1～2周，嚴(yán)重流行時(shí)，產(chǎn)奶量下降到30%，并持續(xù)1個(gè)月[9].

1.3 牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒.該病毒可分為物種、基因型和生物型.根據(jù)病毒RNA序列，可分為11種，其中BVDV1，屬于瘟病毒屬A，BVDV2，屬于瘟病毒屬B.在遺傳學(xué)上BVDV可分為三類：1型(BVDV-1),2型(BVDV-2),HoBi樣病毒 (BVDV-3)；其基因型主要由5′-UTR區(qū)，Npro和E2蛋白編碼區(qū)的變化決定，BVDV-1中至少有20種基因型是最常見(jiàn)的，而較少見(jiàn)的BVDV-2有4種基因型.根據(jù)BVDV在感染細(xì)胞培養(yǎng)物中能否引起細(xì)胞病變，可分為致細(xì)胞病變型(cytopathogenic，CP)和非致細(xì)胞病變型(noncytopathogenic，NCP)兩種生物型[10-11].

BVDV的基因組由長(zhǎng)約12.3 kb的正鏈RNA分子組成，它的單個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)的兩側(cè)是非翻譯區(qū)(UTR).ORF可編碼一個(gè)大的多聚蛋白，經(jīng)細(xì)胞和病毒蛋白酶切割為四種結(jié)構(gòu)蛋白和八種非結(jié)構(gòu)蛋白.這些成熟蛋白質(zhì)包括Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2 、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B.多聚蛋白中的第一種蛋白質(zhì)Npro是非結(jié)構(gòu)病毒自身蛋白酶，產(chǎn)生其自身的C-末端.核衣殼蛋白C和三種包膜糖蛋白Erns，E1和E2代表BVDV的結(jié)構(gòu)蛋白.E2是瘟病毒中高度可變的免疫顯性糖蛋白，是中和抗體的主要靶標(biāo).剩余的成熟蛋白質(zhì)是非結(jié)構(gòu)蛋白.5′-UTR是病毒基因組的高度保守部分，包含涉及病毒多蛋白翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)[12].

BVDV是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病和包括流產(chǎn)在內(nèi)的生殖疾病的主要原因之一.該病毒主要通過(guò)持續(xù)感染導(dǎo)致腸細(xì)胞原發(fā)性損傷、易感動(dòng)物共感染和在隱窩腸細(xì)胞中復(fù)制、病變兩種方式引起犢牛腹瀉[1].這種病毒的感染會(huì)在動(dòng)物身上引起不同的癥狀，也會(huì)以不同的方式發(fā)展疾病.通常，病毒感染可能是無(wú)癥狀或有一些臨床癥狀，比如輕微的發(fā)燒、食欲缺乏、嗜睡，但在一些動(dòng)物中也可以產(chǎn)生口腔潰瘍和消化道感染，引起呼吸系統(tǒng)和生殖的影響以及免疫抑制，在一些情況下可能呈現(xiàn)經(jīng)典或出血性腹瀉.該病毒還可通過(guò)胎盤(pán)傳播，引發(fā)胚胎死亡、流產(chǎn)、免疫耐受、出生缺陷、新生犢牛羸弱[12].

1.4 牛腸道病毒(Bovine enterovirus,BEnV)

牛腸道病毒(Bovine enterovirus,BEnV)屬于小核糖核酸病毒科內(nèi)的腸道病毒屬，是一種無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒.腸道病毒屬由12種組成：9種腸道病毒(EV-A、B、C、D、E、F、G、H和J)和3種鼻病毒(RV-A、B和C)[2,13].EV-E和EV-F屬于BEnV，其中EV-E包括EV-E1～EV-E4，EV-F種包括EV-F1～EV-F6.BEnV的病毒粒子外觀呈球形、正二十面體、無(wú)包膜，大小為25～30 nm，病毒的基因組含有單個(gè)ORF,5′和3′末端為UTR，全長(zhǎng)7.5 kb，是不分節(jié)段的單股正鏈RNA[13-14].BEnV的血清型分類隨著科學(xué)研究的發(fā)展經(jīng)歷了幾次變化，最初它們被分為七種，后來(lái)減少為四種，然后減少為兩種血清型.最近，基于基因序列數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育分析，BEnV被分為兩個(gè)血清群：BEV-A和BEV-B.BEV-A包含三種類型(BEV-A1、BEV-A2和BEV-A3)，BEV-B包含六種類型(BEV-B1、BEV-B2、BEV-B3、BEV-B4、BEV-B5和BEV-B6)[15].

BEnV基因組的ORF編碼單個(gè)長(zhǎng)多聚蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白(在P1區(qū)中編碼的VP1～4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(在P2區(qū)中編碼的2A～C和在P3區(qū)編碼的3A～D)，P2區(qū) 、P3區(qū)和1A(VP4)的蛋白質(zhì)序列高度保守.2C蛋白被認(rèn)為是膜相關(guān)的ATP酶，具有保守的核苷酸結(jié)合基序，衣殼蛋白1B(VP2)，1C(VP3)和1D(VP1)可作為BEnV的基因或血清型分類的依據(jù).有研究表明，大多數(shù)腸病毒屬病毒由VP1、VP2、VP3蛋白組成的外衣殼形成的“溝槽”作為表面受體，其中VP1編碼區(qū)的序列可能決定病毒的表型，可用于研究BEnV[13,15].

BEnV的臨床癥狀廣泛，包括腸道感染(高發(fā)病率、腹瀉和中度死亡率)，呼吸道疾病(咳嗽、發(fā)熱和呼吸困難)，生殖障礙(流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡)和不孕，BEnV還可引起牛的隱性感染，并隨感染犢牛糞便排出體外，但感染犢牛的病毒分離物無(wú)法通過(guò)實(shí)驗(yàn)再現(xiàn)呼吸道和胃腸道疾病，BEnV在牛中的發(fā)病機(jī)制和毒力尚不明確[2,16].

1.5 牛凸隆病毒(Bovine torovirus，BToV)

牛凸隆病毒(Bovine torovirus，BToV)最初由G.N.Woode 等人，于1979年是在美國(guó) Lowa 州 Breda市的腹瀉犢牛中分離出來(lái)的[17].BToV屬于套式病毒目冠狀病毒科凸隆病毒屬，以前被稱為布雷達(dá)病毒，是一種有囊膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒.病毒粒子形態(tài)多樣，根據(jù)血清學(xué)檢測(cè)，布雷達(dá)病毒(Breda virus，BRV)可分為兩種血清型，BRV-1和BRV-2[2,18-20].

BToV的基因組全長(zhǎng)28.475 kb，包含兩個(gè)大的重疊開(kāi)放閱讀框(ORFs)：ORF1a和ORF1b，以及四種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(S)、跨膜蛋白(M)、血凝素酯酶蛋白(HE)、核衣殼蛋白(N)[19,20-22].

ORF1a和ORF1b編碼的蛋白被認(rèn)為與核糖體移碼有關(guān)；HE蛋白和唾液酸-O-乙酰酯酶結(jié)構(gòu)域形成二聚體，這種酯酶區(qū)域?qū)τ谔擒战Y(jié)合O-乙?；耐僖核嵩诖呋瘏^(qū)域的結(jié)合和定位作用非常關(guān)鍵；S蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒內(nèi)吞[19,22].

BToV通常感染2至5日齡的犢牛，1月齡犢牛的病毒脫落物是BToV的主要來(lái)源，4月齡犢牛易感，被認(rèn)為是犢牛的腸道病原體.有研究表明，BToV在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，經(jīng)S蛋白介導(dǎo)進(jìn)入宿主腸細(xì)胞，感染空腸，回腸和結(jié)腸的遠(yuǎn)端半部的上皮，顯微病變?yōu)殡[窩和絨毛狀腸細(xì)胞壞死和絨毛萎縮，感染奶牛會(huì)出現(xiàn)水樣腹瀉，厭食和產(chǎn)奶量減少，有的會(huì)出現(xiàn)輕微呼吸道癥狀[2,22].

1.6 牛諾如病毒(Bovine norovirus，BNoV)

諾如病毒(norovirus，NoVs)屬于杯狀病毒科，是一種無(wú)包膜的RNA病毒.根據(jù)VP1基因序列推斷的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可將諾如病毒分為6個(gè)基因組(GI至GVI).牛諾如病毒(Bovine norovirus，BNoV)是杯狀病毒科諾如病毒屬成員，是一種無(wú)包膜的單股正鏈 RNA病毒.到目前為止，發(fā)現(xiàn)的牛諾如病毒序列聚集在GIII內(nèi)，該基因組可進(jìn)一步細(xì)分為GIII.1和GIII.2兩種基因型[2,23-24].

BNoV是一種小的、無(wú)包膜的二十面體病毒，其病毒粒子的直徑約27～40 nm，基因組全長(zhǎng)約7.5 kb，由三個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)組成.ORF1編碼一個(gè)大的多聚蛋白.該多聚蛋白可被病毒3C樣蛋白酶進(jìn)一步切割成六個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白.這些非結(jié)構(gòu)蛋白從5′端到3′端的順序依次為：N端非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-2(P48)、NS3核苷酸三磷酸酶(NTPase)/RNA 解旋酶，NS4 蛋白(P22)、NS5蛋白(VPg)、NS6蛋白酶(3CLPro)和NS7 RNA依賴的RNA 聚合酶(RdRp，P)在內(nèi)的至少六種非結(jié)構(gòu)蛋白[25].ORF2和ORF3分別編碼主要衣殼蛋白(VP1)和次要衣殼蛋白(VP2).VP1衣殼蛋白組成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：殼體(S結(jié)構(gòu)域，N末端部分)和突出結(jié)構(gòu)域(P結(jié)構(gòu)域，C末端部分).P結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)子結(jié)構(gòu)域：P1和P2，其中P2是一個(gè)高變區(qū)，具有細(xì)胞受體配體和免疫抗原決定簇，使病毒具有外部定位功能[24-27].

BNoV可引起犢牛腹瀉，且對(duì)各個(gè)年齡階段的犢牛均易感，實(shí)驗(yàn)性感染 GIII BNoV株，犢?？漳c中段和遠(yuǎn)端的病變顯著，回腸中的病變輕微，空腸中Peyer’s斑的卵泡相關(guān)上皮(FAE)損傷.空腸和回腸中檢測(cè)到病毒的衣殼抗原，發(fā)生腸上皮壞死、絨毛萎縮和腺窩增生現(xiàn)象，出現(xiàn)輕度腹瀉，短暫性厭食和木糖吸收不良等臨床癥狀，且基因型1比基因型2嚴(yán)重[26]，生殖小牛出現(xiàn)癥狀.目前，對(duì)于BNoV的發(fā)病機(jī)制知之甚少，從其他物種，特別是人類推斷，BNoV可能是經(jīng)糞口途徑，通過(guò)受污染的食物或水傳播[2,23-24,28].

1.7 牛紐布病毒(Bovine nebovirus，BNebV)

牛紐布病毒(Bovine nebovirus,BNebV)與BNoV相似，都是杯狀病毒家族的無(wú)包膜成員，是一種無(wú)包膜的二十面體病毒[2,28].BNebV屬于杯狀病毒科紐布病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒.根據(jù)BNebV推斷的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，BNebV包括三種已知的菌株基因型：NB、NA1和DijonA216[29,31].BNebV的基因組全長(zhǎng)約為7.4 kb，由兩個(gè)開(kāi)放的閱讀框(ORFs)組成.ORF1依次編碼2C解旋酶/NTP酶、3C蛋白酶、RNA依賴的RNA 聚合酶(RdRp)和主要衣殼蛋白(VP1)，ORF2編碼次要衣殼蛋白(VP2，功能未知的蛋白)[30-31].

BNebV是牛急性胃腸炎的重要致病因子，但它的附著因子和可能的其他細(xì)胞受體仍然未知[25].新生犢牛實(shí)驗(yàn)性感染BNebV后2至5天腸道絨毛上皮細(xì)胞損傷和絨毛萎縮，腸道吸收不良，可引起腸道病變和腹瀉.感染BNebV的生殖犢牛的臨床癥狀包括抑郁，厭食和腹瀉.盡管BNebV對(duì)畜牧業(yè)具有顯著的經(jīng)濟(jì)影響并且具有人畜共患潛力的病原體，但BNeV生命周期仍然未知[2,27-28,30].

1.8 牛星狀病毒(Bovine astrovirus，BoAstV)

星狀病毒(astroviruses,AstVs)屬于星狀病毒科，是一種小的、無(wú)包膜的、非節(jié)段單股正鏈RNA病毒.AstVs在分類學(xué)上分為兩個(gè)屬：Mamastrovirus(MAstV)和Avastrovirus(AAstV)，分別感染哺乳動(dòng)物和禽類宿主[32-33].牛星狀病毒(Bovine astrovirus，BAstV)最初于1978年，從英格蘭腹瀉犢牛中分離得到的，是星狀病毒科MAstVs屬的成員[2,32-33].1985年，一項(xiàng)基于血清學(xué)的研究將BAstV分為兩種血清型：BoAstV-1和BoAstV-2，之后有研究表明BAstV可能有多種血清型[34].

AstVs的基因組長(zhǎng)度約6.8～7.9 kb，序列具有高度可變性，由5′-UTR，3個(gè)部分重疊的開(kāi)放閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2)，3′-UTR和poly(A)尾6部分組成.ORF1a和ORF1b位于5′-UTR的末端，ORF1a可編碼非結(jié)構(gòu)性多蛋白(nsp)1a；ORF1b編碼多蛋白1ab，包括RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)，病毒蛋白酶(v-Pro)和許多功能未知的蛋白質(zhì).ORF2編碼的多聚蛋白可被半胱天冬氨酸酶和胰蛋白酶加工形成蛋白衣殼成熟蛋白[32,35-36].

AstVs主要通過(guò)糞口傳播途徑傳播，是引起幼兒和老年人急性胃腸炎的主要原因，是胃腸道的病原體，也是腦炎的潛在病因，已在哺乳動(dòng)物的腹瀉糞便樣本中發(fā)現(xiàn)，也可導(dǎo)致鳥(niǎo)類疾病[34-35,37].BAstV在犢牛中常見(jiàn)，在成年牛中不常見(jiàn)，牛感染BAstV后，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嗜睡、食欲不振、共濟(jì)失調(diào)、反應(yīng)遲鈍等臨床癥狀[2,33,38].早期研究表明，BAstV攻擊犢牛無(wú)致病性，BAstV株被認(rèn)為是非致病性的，但當(dāng)BAstV-USA菌株與BRV或BToV混合感染犢牛時(shí)，犢牛出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉和更廣泛的BAstV感染[2,37].BAstV-USA菌株實(shí)驗(yàn)性感染犢牛后，犢?；啬c的M細(xì)胞和Peyer’s斑的吸收型腸上皮細(xì)胞發(fā)生病理性病變[34].

1.9 牛嵴病毒(Bovine kobuvirus/aichivirus B，BKoV)

牛嵴病毒(Bovine kobuvirus/aichivirus B，BKoV)于 2003 年首次在健康牛的血清和糞便中被發(fā)現(xiàn)，屬于小 RNA 病毒科嵴病毒屬的成員，是一種無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒[21,39].目前國(guó)際公認(rèn)的嵴病毒有兩種：愛(ài)知病毒(Aichivirus，AiV)和BKoV，豬嵴病毒(porcine kobuvirus,PKoV)屬于候選病毒[40].

嵴病毒的基因組長(zhǎng)度為8.2～8.4 kb，由一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)組成，編碼一個(gè)大的多聚蛋白.基因組順序?yàn)椋篤Pg、5′-UTR、前導(dǎo)蛋白(L)、三種結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP3和VP1)、七種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D)、3′-UTR和poly(A)尾.非結(jié)構(gòu)蛋白的3D基因可編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp).根據(jù)編碼蛋白質(zhì)的功能不同，其基因組可分為三個(gè)區(qū)域：P1區(qū)，P2區(qū)和P3區(qū)，其中P1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)衣殼蛋白，P2區(qū)和P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白[39].

BKoV先后在健康牛的血清、糞便和腹瀉牛的糞便樣品中被發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)到，可通過(guò)糞口途徑，以直接傳播的方式，從一種動(dòng)物傳播到另一種動(dòng)物；還可通過(guò)食用受污染的食物或水，以間接傳播的方式進(jìn)行傳播[41-42].有研究表明，BKoV在腸道混合感染中起到一定作用，可引起7～60日齡犢牛腹瀉、發(fā)燒、虛弱和脫水，同時(shí)在有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的牛血清CSF樣本中可初步鑒定出BKoV.然而，它們?cè)谂R床腹瀉和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用仍不清楚，BKoV可能是牛腸道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在病原體[42].

2 診斷技術(shù)

病毒的檢測(cè)和鑒定主要分為病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)三個(gè)方面.病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括：病毒分離鑒定、電鏡技術(shù).血清學(xué)檢測(cè)方法包括：血清中和實(shí)驗(yàn)(SN)、免疫瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、乳膠凝集試驗(yàn)(LAT).分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)[14,43-45].本文以電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)為基礎(chǔ)，展開(kāi)對(duì)牛病毒性腹瀉病毒診斷技術(shù)研究進(jìn)展的闡述.

2.1 電鏡技術(shù)

電鏡技術(shù)是病毒學(xué)研究和病毒診斷的一項(xiàng)基本技術(shù)，可通過(guò)觀察病毒的形態(tài)特征來(lái)鑒定病毒.Mebus等通過(guò)電鏡觀察并首次成功分離出BRV[46].Zhou等人，用非致細(xì)胞病變(NCP)和細(xì)胞病變(CP)BVDV株感染MDBK細(xì)胞，并使用電子顯微鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)方法，研究發(fā)現(xiàn)BVDV誘導(dǎo)自噬，可損害先天免疫應(yīng)答，引起的持續(xù)感染[47].在病毒研究領(lǐng)域最常用的電鏡技術(shù)是免疫電鏡(IEM)技術(shù)，是檢測(cè)BToV的“金標(biāo)準(zhǔn)”[45].此外，常國(guó)權(quán)等還分別用固相免疫電鏡技術(shù)、SPA 蛋白膠體金免疫電鏡負(fù)染色技術(shù)及蛋白A 膠體金免疫電鏡(PAG-IEM)技術(shù)檢測(cè)了包括牛腹瀉相關(guān)病毒在內(nèi)的一些病毒[44].IEM方法對(duì)病毒數(shù)量、儀器精密度等要求比較高，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，僅適用于實(shí)驗(yàn)室少量樣品高精度檢測(cè).免疫金標(biāo)記法、PAG-IEM 技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適用于快速檢測(cè)腹瀉牛糞便、腸內(nèi)容物等樣品中的病毒，但不適用于大量臨床樣本[19,44].

表1 各種牛腹瀉病毒的主要分子生物學(xué)特性

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是一種依賴抗原抗體特異性反應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù).這項(xiàng)試驗(yàn)技術(shù)的出現(xiàn)基于一些重要的科學(xué)進(jìn)步(抗原特異性抗體、單克隆抗體、多克隆抗體的產(chǎn)生)而產(chǎn)生的，具有成本低、快速、敏感性強(qiáng)、特異性高等特點(diǎn)，易于在牧場(chǎng)等基層推廣使用.目前在牛病毒性腹瀉病毒上應(yīng)用的ELISA法包括直接ELISA法、捕獲(間接)ELISA法、阻斷ELISA法、雙抗體(原)夾心 ELISA 法、Ag-ELISA法、間接Dot-ELISA法、斑點(diǎn)ELISA法[14,43-45,48].Armando等利用抗原捕獲ELISA法在犢牛糞便中鑒定出了BToV的抗原和核酸[45].郭金玉等利用野生BEnV-2型的VP1蛋白作為包被抗原，成功建立了檢測(cè)BEnV抗體的間接ELISA方法.該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[49].肖盛中等利用BVDV的重組 Erns 蛋白包被抗原，建立了BVDV抗體的間接ELISA方法.該法敏感性強(qiáng)、特異性高，可用于BVDV的血清流行病學(xué)調(diào)查[50].胡俊英等應(yīng)用制備的BVDV的CC13B毒株的E2蛋白的單克隆抗體與多克隆抗體，建立了基于單抗捕獲BVD-MDV抗原的雙抗體夾心ELISA方法.檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[51].隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包被抗體、捕獲抗體的進(jìn)一步純化，使得Ag-ELISA，一種新的ELISA法產(chǎn)生，并用于A群BRV、BCoV等一些病毒的檢測(cè)，這種方法具有快速、高通量、便攜、即插即用等優(yōu)點(diǎn)，但其敏感性相對(duì)較差[52].Zhao等利用BVDV的重組E2蛋白作為包被抗原，建立了用于檢測(cè)抗BVDV抗體的間接Dot-ELISA，與IDEXX HerdChek BVDV抗體ELISA試劑盒同時(shí)測(cè)試來(lái)自田間奶牛的100份血清樣品的抗BVDV抗體，結(jié)果顯示間接Dot-ELISA的特異性強(qiáng)，靈敏度和準(zhǔn)確度高[53].

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)

PCR是體外生物體的特殊DNA復(fù)制方法，可大量擴(kuò)增特定片段，是一種基于核酸對(duì)病毒病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的方法.其具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)靈敏、快速等特點(diǎn)，但是樣品污染可造成假陽(yáng)性、高突變率病毒(BRV)易出現(xiàn)假陰性的狀況[44].隨后反轉(zhuǎn)錄PCR，即將RNA反轉(zhuǎn)錄為較為穩(wěn)定的cDNA的一種檢測(cè)方法產(chǎn)生.A.E.Hoet等在比較ELISA和RT-PCR對(duì)BToV檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，RT-PCR對(duì)BToV的檢出率更高、更敏感[45].Lung等用建立RT-PCR結(jié)合微陣列檢測(cè)方法，檢測(cè)包括BVDV-1和BVDV-2在內(nèi)的八種與牛各類疾病的病毒.研究發(fā)現(xiàn)，該方法可同時(shí)檢測(cè)大量病原且敏感性強(qiáng)[54].為了更加直觀、精準(zhǔn)、實(shí)時(shí)觀測(cè)PCR，1992年，Higuchi 提出實(shí)時(shí)觀測(cè)PCR整個(gè)過(guò)程的構(gòu)想，1995年，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司研制了首臺(tái)熒光定量 PCR 儀，使得實(shí)時(shí)熒光PCR在研究中開(kāi)始應(yīng)用.實(shí)時(shí)熒光PCR是在雙鏈核酸中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，隨反應(yīng)進(jìn)行PCR產(chǎn)物增多熒光信號(hào)增強(qiáng)，結(jié)合相應(yīng)計(jì)算方法，實(shí)現(xiàn)定量的一種PCR方法[55].實(shí)時(shí)熒光定量PCR常分為染料法(SYBR GreenⅠ)和探針?lè)?TaqMan 熒光探針)兩種.Tsuchiaka等使用TaqMan RT-PCR建立了一種新型同時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)Dembo-PCR，Dembo-PCR可同時(shí)檢測(cè)到共19種引起腹瀉的病原體.采集腹瀉牛糞便，研究發(fā)現(xiàn)BCoV主要引起成年牛腹瀉，BToV主要引起犢牛腹瀉，Dembo-PCR可能是診斷牛腹瀉中感染因子的有力工具[56].Barry等建立了一種基于探針的RT-PCR檢測(cè)方法，可準(zhǔn)確地檢測(cè)出包括BVDV-1和BVDV-2在內(nèi)的可引起牛流產(chǎn)的病原體[57].張永強(qiáng)等人研究了一種新型的TaqMan-MGB 探針，并在奶牛場(chǎng)中對(duì)BVDV感染進(jìn)行檢測(cè).TaqMan-MGB法是在3′端使用無(wú)熒光淬滅基團(tuán)，加小分子物質(zhì)MGB，使得本底信號(hào)強(qiáng)度降低、探針TM值提高10攝氏度的一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，能夠快速、準(zhǔn)確地定量測(cè)定出目標(biāo)基因，且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)[58].Qing Fan等人建立了一種GeXP多重PCR檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)和鑒別BVDV、BRV、IBRV等六種牛場(chǎng)常見(jiàn)感染性病毒[59].近年來(lái)出現(xiàn)了一種新的核酸擴(kuò)增方法—逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP).該方法以PCR原理為基礎(chǔ)通過(guò)識(shí)別靶序列特異區(qū)域的引物和特殊功能的DNA聚合酶，等溫條件下完成擴(kuò)增，加入熒光染料檢測(cè)，結(jié)果可視，具有高效性、特異性、快速性等特征[44,56].

2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是一種常用的分離和檢測(cè)DNA分子的方法，可用于BRV的檢測(cè)，還能對(duì)BRV的種群類型進(jìn)行鑒別[44]，是一種常用的分離和檢測(cè)DNA分子的方法，也可用于BRV的檢測(cè)及其種群類型進(jìn)行鑒別[44].Dhama等對(duì) BRV的RNA利用 PAGE 技術(shù)檢測(cè)，可將 BRV 分為 A～G 7 個(gè)種群，并可檢測(cè)不同病毒基因組的差異和變異[60].Fritzen JTT等利用PAGE技術(shù),結(jié)合RT-PCR測(cè)定和確認(rèn)了0～30日齡接種A群BRV奶牛糞便樣品中RVA的存在，以此監(jiān)測(cè)RVA疫苗的作用[61].PAGE 技術(shù)是犢牛腹瀉臨床樣本中BRV樣品檢測(cè)和鑒別的重要方法，具有操作簡(jiǎn)單、成本低，可用于大量樣本檢測(cè)等優(yōu)勢(shì).隨后發(fā)展了SDS-PAGE技術(shù)，可根據(jù)蛋白質(zhì)分子的一些性質(zhì)將其呈梯度分開(kāi).Li等成功構(gòu)建了抗BVDV納米抗體基因文庫(kù)，高質(zhì)量的噬菌體展示納米抗體庫(kù)，并在大腸桿菌中表達(dá)BVDV-E2蛋白，用SDS-PAGE分析觀察其與預(yù)期的納米抗體大小一致.結(jié)果表明，使用噬菌體展示技術(shù)可分離出一種對(duì)BVDV表現(xiàn)出高親和力和特異性的納米抗體[62].

表2 不同檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

3 小結(jié)

腹瀉是牛群體高發(fā)的疾病，也是引起犢牛發(fā)育不良甚至死亡的重要原因.目前研究發(fā)現(xiàn)，病毒是引起牛傳染性疾病的主要原因.引起牛病毒性腹瀉的病毒主要有BRV、BCoV、BVDV、BEnV.此外，BToV、BNoV、BNebV、BoAstV、BKoV與牛腹瀉也存在潛在聯(lián)系.由于某些病毒如BCoV、BVDV、BEnV引起牛腹瀉的臨床癥狀相似，給臨床診斷帶來(lái)了一些困難.因此，出現(xiàn)了很多檢測(cè)、診斷病毒的方法，如IEM、RT-PCR、ELISA、PAGE，這些檢測(cè)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用時(shí)，要結(jié)合自身實(shí)際選用一種或幾種方法進(jìn)行檢測(cè)和診斷.隨著生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，相信不久的將來(lái)，對(duì)某病毒是否直接引起牛腹瀉、通過(guò)怎樣的方式引起牛腹瀉會(huì)有更深入和明確的研究，同時(shí)，檢測(cè)與診斷方法也會(huì)不斷改進(jìn)和完善.