冶昡青，杜江龍，劉振斌，喬自林，馮玉萍

(西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

微載體是一類無(wú)毒性、非剛性、密度均一的高分子微球.微載體培養(yǎng)技術(shù)首先由WEZEL[1-3]等于1967年提出，經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，目前已成為生物醫(yī)藥制品領(lǐng)域主導(dǎo)的生產(chǎn)方法.在國(guó)內(nèi)，微載體培養(yǎng)技術(shù)相對(duì)滯后，主要原因是培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器和微載體三方面都依賴于進(jìn)口.瓊脂是由瓊脂糖和硫瓊膠組成的無(wú)特異性的吸附蛋白，是理化性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好的高分子聚合物[4-8]，將瓊脂固化交聯(lián)制備后精確篩選大小得到瓊脂微球.在微球表面引入一些親和性配基后，將此瓊脂微球用作親和層析介質(zhì)，一方面保證了純植物源性生物材料作為原料，另一方面又解決了瓊脂糖原料昂貴的問(wèn)題[9]. 口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot And Mouthdisease Virus,FMDV)感染而引起的偶蹄動(dòng)物共患的急性發(fā)熱性傳染疾病，它有畜牧業(yè)“頭號(hào)殺手”的稱號(hào)，故而口蹄疫的防治始終受到世界各國(guó)的重視[10-12].目前，口蹄疫滅活疫苗的接種是預(yù)防和控制口蹄疫發(fā)生并流行的最主要方法.通過(guò)采用純化技術(shù)，分離與純化疫苗的免疫活性成分，去除其他生物源性雜質(zhì)成分，能夠較好地降低或避免疫苗接種后發(fā)生副反應(yīng)，從而大大增加了病毒疫苗的安全性.馬全英[13]等人利用離子交換層析法，分離純化了口蹄疫病毒抗原,結(jié)果表明.在一定條件下，利用陰離子交換樹脂可以制備出高純度的FMDV抗原[8]. 親和層析，是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，從而使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法[14-16].親和層析介質(zhì)具有較大的載量，較強(qiáng)的分離性和較高的選擇性，可使待分離的生物大分子，從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái),達(dá)到千倍以上的純化,又能保持較高的活性[17-19].親和層析技術(shù)是分離純化和分析病毒、抗原、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞器、激素、抑制劑、糖蛋白、結(jié)合蛋白、酶、核酸等生物大分子的有力工具[20,21]. 本文以自制陰離子交換劑瓊脂微球?yàn)榉蛛x純化用介質(zhì)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn).在不同條件下，給瓊脂微球表面偶聯(lián)氨基，用凱氏定氮法測(cè)定含氮量，篩選出偶聯(lián)效果最佳的分離純化介質(zhì)，并利用該介質(zhì)分離純化口蹄疫滅活病毒抗原，檢測(cè)其分離純化效果.其目的是在初步探究瓊脂微球最優(yōu)偶聯(lián)氨基化合物的反應(yīng)條件，以及該自制親和層析介質(zhì)在分離純化口蹄疫滅活病毒抗原方面的應(yīng)用效果.綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究開發(fā)瓊脂微球陰離子交換介質(zhì)在口蹄疫病毒抗原的分離純化中提供了一定的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂粉(上海山浦化工，分析純)，氫氧化鈉(煙臺(tái)市雙雙化工，分析純)，環(huán)氧氯丙烷(煙臺(tái)市雙雙化工，分析純)，99%B-苯乙胺(上海阿拉丁有限公司，分析純)，鹽酸(山東恒通化工股份有限公司，分析純)，硼酸(江西省南華貿(mào)易有限公司，分析純)，溴甲酚綠(天津市凱信化學(xué)有限公司，分析純)，甲基紅(天津市凱信化學(xué)有限公司，分析純)，TRIS(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，分析純)，試驗(yàn)用水為去離子水.

電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，HJ-6A多頭加熱磁力攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)，全自動(dòng)凱氏定氮儀(丹麥福斯公司)，循環(huán)水式多用真空泵SHZ-95B型(上海耀特儀器設(shè)備有限公司)，AKTA PURIFIER蛋白純化儀(GE HEALTHCARE公司)，酸度計(jì)SG-2型(梅特勒-托利多儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 瓊脂微球的制備

準(zhǔn)確配制4%的瓊脂溶液[18]作為水相.按照100∶1的體積比配制環(huán)己烷和司盤-80的混合溶液作為油相，在攪拌的條件下,將水相緩慢地倒入油相,保溫乳化一段時(shí)間后降至室溫,停止攪拌,洗滌[19].

1.2.2 瓊脂微球的交聯(lián)固化

用75 μm和100 μm的銅篩篩選出大小75 μm～100 μm的瓊脂微球，稱取該微球15 g，去離子水洗凈靜置濾干，微球中加入3 mol/L的NaOH溶液30 mL，再加入15 mL的環(huán)氧氯丙烷活化劑，保持一定速度，40 ℃恒溫?cái)嚢?.5 h.

1.2.3 交聯(lián)瓊脂微球表面氨基的偶聯(lián)

取75 μm～100 μm交聯(lián)后抽干的瓊脂微球15 g，加入2 mol/L的NaOH溶液，再加入β-苯乙胺，攪拌狀態(tài)下加熱至50 ℃，反應(yīng)一段時(shí)間后依次用自來(lái)水、去離子水洗凈，于25%的乙醇溶液中，4 ℃保存瓊脂微球.為了確定偶聯(lián)氨基的最優(yōu)工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了L9(34)正交試驗(yàn)(見表1).試驗(yàn)考察了苯乙胺的量，NaOH的量三個(gè)因素對(duì)偶聯(lián)效果的影響，采用凱氏定氮測(cè)得氮含量評(píng)價(jià)偶聯(lián)效果.

1.2.4 偶聯(lián)效果的檢測(cè)

稱取純水洗凈抽干的待測(cè)偶聯(lián)氨基的微載體各0.2 g，分別加入濃硫酸10 mL，催化劑(由0.1 g CuSO4·5H2O和1.5 g K2SO4制做而成)一片.將氫氧化鈉3.5 g，0.1%的溴甲酚綠40 μL，溶于50 mL去離子水，加入抽酸儀中(抽酸儀中的溶液呈現(xiàn)藍(lán)色后不再添加)420 ℃消化樣品1 h.待冷卻后凱氏定氮儀上分別蒸餾樣品，再用0.1 N-HCl滴定三角瓶?jī)?nèi)樣液至其剛好變?yōu)闇\紫色，記錄消耗鹽酸用量，實(shí)驗(yàn)組記為Tn，空白組中消耗鹽酸最少用量記為Dmin，計(jì)算總蛋白含量最高的一組樣品.

待測(cè)樣品含氮量：F(%)=(Tn-Dmin)×14.007×CHCl×100%/mn

待測(cè)樣品總蛋白含量：FN(%)=F(%)×6.25.

注：mn單位為mg

1.2.5 瓊脂微球?qū)谔阋卟《痉蛛x純化效果檢測(cè)

分別取洗凈抽干的藥廠口蹄疫病毒抗原分離純化介質(zhì)和偶聯(lián)氨基效果最佳的瓊脂微球各15 g，溶于10 mL去離子水，安裝于層析柱，平衡層析柱后啟動(dòng)AKTA PURIFIER蛋白純化儀.取3 mL的口蹄疫滅活病毒抗原，上樣1 mL，10 mmol/mL、pH為8.0、含有0.15 M的NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫純化后的口蹄疫滅活病毒抗原，收集3 mL/管洗脫液.對(duì)口蹄疫滅活病毒抗原進(jìn)行分離純化，最終得到二者的層析柱效圖.對(duì)柱效圖所顯示的口蹄疫滅活病毒抗原洗脫峰的出峰時(shí)間、出峰高度和出峰面積進(jìn)行比較.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 氨基偶聯(lián)結(jié)果

待測(cè)樣品含氮量F(%)=(Tn-Dmin)×14.007×CHCl×100%/mn

將各組實(shí)驗(yàn)中的Tn、Dmin、mn值和CHCl代入式(3)得表2結(jié)果.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中的R(極差)進(jìn)行比較表明：正交試驗(yàn)中的三個(gè)主要因素對(duì)瓊脂微球含氮量的影響主次順序依次為A(苯乙胺的量)> C(偶聯(lián)時(shí)間)>B(NaOH的量).三個(gè)主要因素對(duì)瓊脂微球含氮量的影響均遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)誤差(空列)的影響.

均值分析表明：活化后的瓊脂微球在20 mL 2 M的 NaOH水溶液，6 mL的苯乙胺，50 ℃偶聯(lián)反應(yīng)2.5 h的條件下，偶聯(lián)效果最佳，最優(yōu)偶聯(lián)條件下瓊脂微球介質(zhì)的含氮量為0.4486%.

2.2 分離純化口蹄疫病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果及討論

圖1和圖2中的層析柱效圖，均裝于高4 cm，直徑2 cm的層析柱中，在AKTA purifier層析儀下分離純化樣液所得.樣液均為A藥廠提供的口蹄疫滅活病毒抗原，層析過(guò)程中樣液流速均為1 mL/min.

圖1A所用介質(zhì)，是A藥廠的介質(zhì)X，具體制備工藝及成分不明，用于分離純化口蹄疫滅活病毒抗原.該圖前兩個(gè)洗脫峰為雜蛋白的洗脫峰，出峰時(shí)間為第2.14 min和第5.11 min.最后一個(gè)洗脫峰為口蹄疫滅活病毒抗原的洗脫峰，出峰時(shí)間為第36.92 min，出峰高度為5.720 Mau，出峰面積為18.5259 Mau mL.

A：A藥廠口蹄疫滅活病毒抗原層析介質(zhì)柱效圖 B：本實(shí)驗(yàn)室口蹄疫滅活病毒抗原層析介質(zhì)柱效圖

圖2 自制口蹄疫滅活病毒抗原層析介質(zhì)柱效圖

圖1B所用介質(zhì)，是本實(shí)驗(yàn)室先前制備的用于分離純化口蹄疫滅活病毒抗原的層析介質(zhì)Z，所用材料與本次實(shí)驗(yàn)相同，但實(shí)驗(yàn)條件不同.用介質(zhì)Z親和層析口蹄疫滅活病毒抗原，得到第一個(gè)洗脫峰是雜蛋白的洗脫峰，出峰時(shí)間為第4.6 min.第二個(gè)洗脫峰為口蹄疫滅活病毒抗原的洗脫峰，出峰時(shí)間為15.89 min，出峰高度為8.399 Mau，出峰面積為15.2659 Mau mL.

圖2所用介質(zhì)，是本次實(shí)驗(yàn)偶聯(lián)苯乙胺效果最佳的親和層析介質(zhì).用該介質(zhì)親和層析口蹄疫滅活病毒抗原，得到第一個(gè)洗脫峰是雜蛋白的洗脫峰，出峰時(shí)間為第5.15 min.第二個(gè)洗脫峰為口蹄疫滅活病毒抗原的洗脫峰，出峰時(shí)間為35.85 min，出峰高度為5.023 Mau，出峰面積為18.3672 Mau mL.

層析柱效圖和數(shù)據(jù)顯示,相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室之前制備的分離純化口蹄疫滅活病毒抗原的介質(zhì)Z，本次實(shí)驗(yàn)制備的介質(zhì)具有更長(zhǎng)高度、更大面積的洗脫峰，在分離純化口蹄疫滅活病毒抗原方面具有更優(yōu)的層析效果.本次實(shí)驗(yàn)制備的親和介質(zhì)在分離純化口蹄疫滅活病毒抗原時(shí)，抗原的出峰時(shí)間、出峰高度及出峰面積與A藥廠的層析介質(zhì)X的數(shù)據(jù)基本一致.結(jié)果表明，自制的該親和層析介質(zhì)對(duì)于口蹄疫滅活病毒抗原有較優(yōu)的分離純化效果.

3 結(jié)論

親和層析柱效結(jié)果表明，本研究最優(yōu)偶聯(lián)條件下，偶聯(lián)了苯乙胺的瓊脂微球介質(zhì)對(duì)口蹄疫滅活病毒抗原具有較好的分離純化作用,在口蹄疫滅活病毒抗原分離純化方面提供了一定的參考依據(jù).本研究中，瓊脂微球表面偶聯(lián)苯乙胺的最優(yōu)條件是：瓊脂微球15 g，濃度為3 M的NaOH水溶液30 mL，環(huán)氧氯丙烷15 mL，40 ℃活化反應(yīng)3.5 h；濃度2 M的NaOH水溶液20 mL，6 mL苯乙胺，50 ℃偶聯(lián)反應(yīng)2.5 h，測(cè)得該微球的含氮量是0.4486%.