汪佳維，王華磊，趙 致，劉紅昌，羅春麗，陳松樹

(貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

滇重樓[Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]為延齡草科 (Trilliaceae) 重樓屬(Paris)多年生草本植物，又名重樓一枝箭、獨角蓮、七葉一枝花和兩把傘等，主要分布于云南、四川和貴州等地，生長于海拔1 400～3 100 m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡中[1-2]，在抗癌、清熱解毒、止血、抑菌、抗炎、防治心血管疾病等方面具有重要的藥用價值[3-4]。

滇重樓種子存在較長的休眠期，需要經(jīng)過兩冬一夏才能出苗，且自然生長條件下出苗率低[5]，為滇重樓的人工種植增加了難度。滇重樓種子的休眠類型為綜合性休眠，果實成熟后胚發(fā)育還不完全，且種皮和胚乳中存在萌發(fā)抑制物[6]。張家玲等[7]研究了不同激素處理對滇重樓種子萌發(fā)的影響，得出赤霉素(GA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)均可促進(jìn)滇重樓種子的萌發(fā)。趙程等[8]研究了GA和氟啶酮(FL)協(xié)同作用對肉蓯蓉種子發(fā)芽的影響，發(fā)現(xiàn)2種植物生長調(diào)節(jié)劑組合可有效提高肉蓯蓉種子的發(fā)芽率。蘇賀等[9]用GA和FL處理巫山淫羊藿種子，可有效打破其休眠。陳疏影等[10]研究表明，滇重樓更多還原種子層積過程中GA含量顯著升高，ABA含量顯著下降。在此基礎(chǔ)上，采用不同濃度GA和FL及不同層積溫度分別處理滇重樓種子，通過分析處理后種子的萌發(fā)情況，篩選解除滇重樓種子休眠的適宜方法，為滇重樓種苗的快速繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試滇重樓種子由云南紅河學(xué)院薛春麗老師提供，采收后洗去外果皮，于陰涼通風(fēng)處保存。供試主要試劑為GA和FL。

1.2 試驗方法

1.2.1 滇重樓種子的千粒質(zhì)量及吸水率變化 采用百粒法測定，每次隨機取100粒種子，脫去外果皮，稱其質(zhì)量，重復(fù)10次，取平均值[11]。種子千粒質(zhì)量(g)=10×平均100粒種子質(zhì)量(g)。

將新鮮滇重樓種子洗去外果皮，晾干水分，取30粒稱質(zhì)量，作為吸水前的原始質(zhì)量，在室溫下置于燒杯中加蒸餾水進(jìn)行吸脹，分別于 2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96 h取出種子，用濾紙吸干種子表面水分稱質(zhì)量，重復(fù)3次。根據(jù)吸水速率繪制吸水率曲線[12]。

種子吸水率(Yt)=(Xt-X0)/X0×100%，X0為30粒滇重樓種子的原始質(zhì)量(g)，Xt為吸脹t小時30粒種子的質(zhì)量(g)[13]。

1.2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對滇重樓種子發(fā)芽的影響 分別設(shè)置GA質(zhì)量濃度為0、100、200、300、400、500、600 mg/L，對滇重樓種子進(jìn)行浸種24 h處理，根據(jù)發(fā)芽率、發(fā)芽勢和爛種率統(tǒng)計結(jié)果，選擇發(fā)芽效果最好的3個GA質(zhì)量濃度水平與4個FL質(zhì)量濃度( 0、5、10、20 mg/L ) 完全組合，進(jìn)行二因素完全隨機試驗設(shè)計，同時以蒸餾水預(yù)處理作對照(CK)。采用雙層濾紙培養(yǎng)法，將預(yù)處理后的種子(種子無需消毒)置于墊有棉花及雙層濾紙的培養(yǎng)皿上，每皿 100 粒，每個處理重復(fù) 3 次，于 20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d調(diào)查1次，胚根突破種皮視為發(fā)芽，調(diào)查過程中把爛種取出并計數(shù)，若發(fā)現(xiàn)濾紙發(fā)霉及時更換。

發(fā)芽率=累計發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%，

發(fā)芽勢=第30天的發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%，

爛種率=霉?fàn)€種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.2.3 不同層積溫度對滇重樓種子胚率的影響 設(shè)置恒溫沙藏溫度為0、5、10、20 ℃，變溫沙藏溫度為20 ℃(45 d)—5 ℃(30 d)—20 ℃(75 d)，以常溫25 ℃作為對照。將洗去種皮的新鮮滇重樓種子用蒸餾水浸種24 h，移入裝有濕沙的玻璃瓶中，每瓶100粒滇重樓種子，每個處理重復(fù)3次。每隔30 d取樣1次，每次各處理取10粒種子，共取4次樣。用解剖刀將種子沿中間對半切開，在體式顯微鏡下觀察并測量種胚和胚乳的長度，計算平均胚率，然后統(tǒng)計和觀察不同層積溫度下滇重樓種子種胚的生長變化[10]，胚率=胚長/胚乳長。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和DPS 2.0整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計及方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及爛種率的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓種子的千粒質(zhì)量及吸水率變化

經(jīng)測定，滇重樓種子千粒質(zhì)量為(51.34±0.03)g。由圖1可以看出，吸脹0～24 h，滇重樓種子吸水率快速上升；吸脹24～60 h，種子吸水率上升趨勢逐漸變緩；吸脹60 h后種子吸水率趨于穩(wěn)定。整體來看，滇重樓種子的吸水性不強，吸水率最高僅為5.7%。

圖1 滇重樓種子的吸水率曲線Fig.1 Water absorption rate curve in seeds of Paris polyphylla var.yunnanensis

2.2 不同質(zhì)量濃度GA對滇重樓種子發(fā)芽的影響

2.2.1 發(fā)芽率 滇重樓種子從第20天開始陸續(xù)發(fā)芽。由表1可以看出，不同質(zhì)量濃度GA處理滇重樓種子均能夠發(fā)芽，且發(fā)芽率均高于對照，說明GA對滇重樓種子發(fā)芽具有促進(jìn)作用。GA質(zhì)量濃度為100～300 mg/L時滇重樓種子發(fā)芽率均較高，其中GA質(zhì)量濃度為300 mg/L時發(fā)芽率達(dá)到最高(79.00%)，但3個質(zhì)量濃度處理間無顯著差異。GA質(zhì)量濃度為400～600 mg/L時，滇重樓種子發(fā)芽率隨GA質(zhì)量濃度升高呈下降趨勢。

表1 赤霉素對滇重樓種子發(fā)芽的影響Tab.1 Effects of gibberellin on seeds germination of Paris polyphylla var.yunnanensis %

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note:Different letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

2.2.2 發(fā)芽勢 由表1所示，不同質(zhì)量濃度GA處理的滇重樓種子發(fā)芽勢均高于對照，且不同處理間差異顯著，說明GA能顯著提高滇重樓種子的發(fā)芽勢。GA質(zhì)量濃度為300 mg/L時發(fā)芽勢最高(54.33%)，其次是200、100 mg/L處理，GA質(zhì)量濃度為400～600 mg/L時發(fā)芽勢降低。

2.2.3 爛種率 由表1所示，不同質(zhì)量濃度GA處理下的滇重樓種子爛種率差異較大，100～300 mg/L GA處理時爛種率較低，且均與對照無顯著差異。GA質(zhì)量濃度為400～600 mg/L時，爛種率隨GA質(zhì)量濃度升高而逐漸加大，600 mg/L GA處理時爛種率達(dá)到最高(13.00%)，且與對照差異顯著。說明滇重樓種子的爛種率隨GA濃度升高而增加。

綜上可得出，GA質(zhì)量濃度為100、200、300 mg/L時有助于滇重樓種子的萌發(fā)，可用于后續(xù)與FL的組合試驗。

2.3 不同質(zhì)量濃度GA和FL組合對滇重樓種子發(fā)芽的影響

2.3.1 發(fā)芽率 由表2可見，單獨使用GA、FL以及GA+FL組合對滇重樓種子發(fā)芽率的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.001、P<0.004以及P=0.001)。由F值可以看出，GA對滇重樓種子發(fā)芽率的影響最大(F=70.598)，其次是GA+FL(F=18.680)，F(xiàn)L組合對滇重樓種子發(fā)芽率的影響最小(F=13.396)。

表2 赤霉素、氟啶酮組合對滇重樓種子發(fā)芽率的影響方差分析Tab.2 ANOVA for effects of gibberellin and fluridone on germination rate of Paris polyphylla var.yunnanensis seeds

由圖2可見，單獨使用FL處理滇重樓種子發(fā)芽率差異顯著且總體上表現(xiàn)為低于單獨使用GA處理和GA+FL組合，單獨使用GA處理的發(fā)芽率較高且處理間差異不顯著，GA+FL組合處理間差異顯著。所有處理中以300 mg/L GA+10 mg/L FL處理(GA300+FL10)發(fā)芽率最高(81.33%)，其次是GA200+FL20處理(80.33%)，對照GA0+ FL0發(fā)芽率最低(19.33%)。

2.3.2 發(fā)芽勢 由表3可見，單獨使用GA、FL處理以及GA+FL組合對滇重樓種子發(fā)芽勢的影響均極顯著(P<0.001、P<0.004以及P=0.001)，由F值可以看出，GA對滇重樓種子發(fā)芽勢的影響最大(F=48.187)，其次是FL(F=32.143)，GA+FL組合影響最小(F=17.291)。

由圖3可見，單獨使用FL處理間滇重樓種子發(fā)芽勢差異顯著且整體低于對照，單獨使用GA及GA+FL組合的發(fā)芽勢處理間差異顯著。所有處理中，以GA300+FL0處理發(fā)芽勢最高(54.33%)，其次是GA300+FL20處理(38.33%)，GA0+FL5處理發(fā)芽勢最低，僅為2.67%。

GA、FL后數(shù)字表示質(zhì)量濃度(mg/L);不同字母表示單獨使用GA、FL以及GA+FL組合內(nèi)分別差異顯著(P<0.05The figures after GA and FL indicate the mass concentration(mg/L);Different letters indicate significant difference(P<0.05圖2 赤霉素、氟啶酮組合對滇重樓種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of gibberellin and fluridone combination on seed germination rate of Paris polyphylla var.yunnanensis

表3 赤霉素、氟啶酮對滇重樓種子發(fā)芽勢的影響方差分析
Tab.3 ANOVA for effects of gibberellin and fluridone on germination potential ofParispolyphyllavar.yunnanensisseeds

誤差來源Errorsourcedf平方和Sumofsquares均方MeansquareFPGA33320.9171106.97248.187<0.001FL356.25018.75032.143<0.004GA+FL92727.866303.09617.291<0.001

圖3 赤霉素、氟啶酮組合對滇重樓種子發(fā)芽勢的影響Fig.3 Effect of gibberellin and fluridone combination on seed germination potential of Paris polyphylla var.yunnanensis

2.3.3 爛種率 由表4可見，F(xiàn)L處理對滇重樓種子爛種率影響極顯著(P=0.006)，GA+FL組合處理影響顯著(P=0.035)，GA處理對滇重樓種子爛種率影響不顯著(P=0.216)。由F值可以看出，F(xiàn)L對滇重樓種子爛種率影響最大(F=12.250)，其次是GA+FL(F=4.142)，GA影響最小(F=2.000)。

表4 赤霉素、氟啶酮對滇重樓種子爛種率的影響方差分析 Tab.4 ANOVA for effects of gibberellin and fluridone on seed rotten rate of Paris polyphylla var.yunnanensis seeds

由圖4可見，單獨使用FL處理間滇重樓種子的爛種率差異顯著，且隨FL質(zhì)量濃度增大而逐漸增大。單獨使用GA的爛種率整體較低且與GA0+FL0(CK)差異不顯著，GA+FL處理高于GA0+FL0(CK)。所有處理中，GA200+FL10處理爛種率最高(4.33%)，其次是GA100+FL20處理(4.00%)，GA100+FL0、GA300+FL0處理最低(均為0.67%)。

圖4 赤霉素、氟啶酮組合對滇重樓種子爛種率的影響Fig.4 Effect of gibberellin and fluridone combination on seed rotten rate of of Paris polyphylla var.yunnanensis

通過對GA、FL處理滇重樓種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及爛種率的統(tǒng)計分析可得出，單獨使用GA、FL和GA+FL組合都能有效解除滇重樓種子的休眠。GA、FL和GA+FL組合處理滇重樓種子發(fā)芽率影響均極顯著；對于發(fā)芽勢，影響最顯著的是GA，其次是FL；對于爛種率，F(xiàn)L影響極顯著，且隨FL質(zhì)量濃度增加而增大，GA處理爛種率較低。

2.4 不同層積溫度對滇重樓種子胚率的影響

由圖5可見，滇重樓種子胚率總體上隨層積時間推移逐漸增大，不同層積溫度處理種子胚率的增長速度不同。0、5、10 ℃低溫條件下種子胚率增長緩慢，且低于對照(25 ℃)；20 ℃條件下滇重樓種子胚率增長最快，遠(yuǎn)高于對照(25 ℃)，到層積60 d左右時，胚突破種皮開始萌發(fā)；變溫[20 ℃(45 d)—5 ℃(30 d)—20 ℃(75 d)]下，在45 d后放入5 ℃環(huán)境開始胚率增長速度與恒溫20 ℃相比明顯下降且與對照(25 ℃)增長速度相差不大，即使在75 d后再次放回20 ℃環(huán)境中胚率增長也比較緩慢。說明低溫、常溫、變溫處理都不能很好地解除滇重樓種子的休眠，而在恒溫20 ℃條件下可以在較短時間內(nèi)打破種子休眠。

圖5 滇重樓種子不同溫度層積過程中胚率的變化Fig.5 Embryo rate change during different temperature stratification of Paris polyphylla var.yunnanensis

3 結(jié)論與討論

滇重樓種子具有較長的休眠期，休眠類型為綜合性休眠，其形態(tài)休眠中的胚休眠是滇重樓種子休眠的主要因素，種子中存在萌發(fā)抑制物抑制胚的形態(tài)后熟[6]；在滇重樓種子的生長發(fā)育過程中，GA、IAA、ZR含量顯著升高，ABA含量顯著下降且變化量較大[14-15]。目前，在激素處理方面，可以通過添加2，4-D、NAA、GA等促進(jìn)滇重樓種子的萌發(fā)[16-18]。本試驗中，單獨使用GA處理滇重樓種子也表現(xiàn)出了促進(jìn)使用，另外還發(fā)現(xiàn)，隨著GA質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢逐漸降低，爛種率加大。FL可以抑制種子類胡蘿卜素的合成從而減少ABA的合成[19]。GA+FL組合作用可有效促進(jìn)滇重樓種子的發(fā)芽，發(fā)芽率最高的處理出現(xiàn)在GA+FL組合中(GA300+FL10，81.33%)，與張家玲等[7]得出的500 mg/L GA處理的滇重樓種子發(fā)芽率(82.36%)相當(dāng)，但在此基礎(chǔ)上降低了GA的使用濃度，且與使用500 mg/L GA相比降低了發(fā)芽時的爛種率。因此，確定GA300+FL10為解除滇重樓種子休眠的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑處理。

滇重樓種子存在生理休眠，需要經(jīng)過一定的層積處理打破休眠。有研究表明，低溫沙藏可以促進(jìn)北沙參種子的萌發(fā)[20]，打破鐵包金種子休眠[21],顯著提高種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率。關(guān)于滇重樓種子最適萌發(fā)溫度的研究中，大多數(shù)認(rèn)為恒溫20 ℃為最佳溫度，也有研究認(rèn)為變溫層積可在較短時間打破滇重樓種子休眠[7]。本研究通過對不同溫度層積處理下滇重樓種子胚率的變化研究可以發(fā)現(xiàn)，滇重樓種子胚的生長變化與溫度有很大的聯(lián)系，不同溫度下胚的生長變化差異極顯著。在常溫(25 ℃)、低溫(0、5、10 ℃)以及變溫(20 ℃—5 ℃—20 ℃)條件下胚率增長緩慢，不能有效打破滇重樓種子的休眠，只有在恒溫20 ℃條件下胚率增長較快，可有效打破休眠，與李寶等[17]的研究結(jié)果一致，且在層積60 d左右時胚就突破種皮開始萌發(fā)。