馬培培，周子鍵，赫可偉，宋云霞，吳建宇

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

玉米種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)資料之一，種子的質(zhì)量是確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要前提和基礎(chǔ)。到目前為止，發(fā)芽率和純度被認(rèn)為是種子質(zhì)量的主要指標(biāo)。帶菌種子會(huì)縮短其貯藏時(shí)間，造成種子劣變，發(fā)芽率降低，引起苗期病害，此外種子所攜帶病菌也是許多病害的初侵染源[1-3]。擬輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)是玉米重要的種傳病原真菌之一，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量和人畜安全。種子表面的病原菌可以通過(guò)消毒和包衣控制，然而種內(nèi)潛伏的擬輪枝鐮孢菌很難通過(guò)化學(xué)防控的方法解決[4]。因此，研究玉米種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性機(jī)制，挖掘、利用抗病基因資源并選育相應(yīng)的抗病品種，具有重要的理論和生產(chǎn)意義。

針對(duì)玉米種子的抗性，一些遺傳研究工作相繼被報(bào)道。張繼敏[5]對(duì)玉米接種黃曲霉，通過(guò)對(duì)重組自交系(Recombinant inbred line，RIL)群體進(jìn)行連鎖分析，檢測(cè)到6個(gè)玉米黃曲霉的抗性QTL(Quantitative trait loci)，分別位于第4、5、6、8、10號(hào)染色體。OUNOLA等[6]通過(guò)連鎖和關(guān)聯(lián)作圖研究玉米Lipoxygenases(LOXs)基因?qū)S曲霉毒素積累的影響，共鑒定出13個(gè)位點(diǎn)。琚銘[7]利用RIL群體通過(guò)種子浸泡菌液法接種，在3個(gè)環(huán)境進(jìn)行抗性鑒定，定位出8個(gè)QTL，其中有5個(gè)QTL與已報(bào)道的玉米穗腐病抗性QTL位點(diǎn)一致，另外3個(gè)QTL是種子抗性所特有的。這些研究都集中在種子對(duì)外部擬輪枝鐮孢菌的抗性上，關(guān)于種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性研究鮮有報(bào)道。為此，以玉米R(shí)IL群體為試驗(yàn)材料，創(chuàng)造攜帶擬輪枝鐮孢菌的種子并于室內(nèi)培養(yǎng)，以發(fā)病等級(jí)為指標(biāo)，對(duì)玉米種子內(nèi)部抗擬輪枝鐮孢菌QTL進(jìn)行定位，旨在進(jìn)一步闡述玉米種子抗病機(jī)制，比較玉米種內(nèi)與種外抗性差別，為玉米抗病遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以抗病玉米自交系BT-1與感病玉米自交系N6(圖1)構(gòu)建的RIL群體(F10)及2個(gè)親本為遺傳研究材料。其中，自交系BT-1來(lái)源于骨干自交系8085，屬于蘇灣血緣。自交系N6是黃早4的改良材料，屬于塘四平頭血緣，對(duì)多種病害高感但具有較好的綜合農(nóng)藝表現(xiàn)。2個(gè)親本自交系BT-1和N6分別對(duì)種內(nèi)潛伏擬輪枝鐮孢菌具有較高和較低的抗性。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳建宇教授課題組前期已經(jīng)構(gòu)建了該RIL群體的遺傳連鎖圖譜[8]，并進(jìn)行了一些相關(guān)性狀(種子[7]、穗長(zhǎng)[9]、株高及穗位高[10])的分析。

圖1 抗病玉米自交系BT-1和感病玉米自交系N6的擬輪枝鐮孢菌感染情況Fig.1 Fusarium verticillioides infection grades of disease resistant maize inbred line BT-1 and susceptible maize inbred line N6

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

RIL群體以及2個(gè)親本被種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)(鄭州：2016年春播、2016年夏播、2017年夏播、2018年夏播,依次標(biāo)為環(huán)境Ⅰ、環(huán)境Ⅱ、環(huán)境Ⅲ、環(huán)境Ⅳ)，行長(zhǎng)2 m，行間距0.67 m，每行播種10株。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，種植2個(gè)重復(fù)。采用單粒播種并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)田間管理。采用DONG等[11]的方法利用擬輪枝鐮孢菌對(duì)生長(zhǎng)中的玉米果穗進(jìn)行預(yù)接種(圖2)。使用5×106個(gè)/mL的擬輪枝鐮孢菌孢子懸浮液對(duì)授粉后15 d的玉米果穗進(jìn)行穗腐病接種。

圖2 玉米果穗接種擬輪枝鐮孢菌的部位Fig.2 Fusarium verticillioides inoculation site of maize ear

通過(guò)注射法將1 mL接種液接種到RIL群體以及2個(gè)親本自交系的果穗中部，每個(gè)材料接種10穗。接種后的果穗用紙膠帶封住傷口，以減少周?chē)h(huán)境對(duì)發(fā)病的影響。

1.3 調(diào)查方法

將收獲后的玉米風(fēng)干，從每個(gè)穗子接種點(diǎn)的上方、左側(cè)和右側(cè)分別選取10個(gè)毗鄰穗腐癥狀籽粒的無(wú)明顯發(fā)病癥狀的種子(以保證這些種子攜帶近似的擬輪枝鐮孢菌)，用75%乙醇浸泡30～50 s，然后用3%的次氯酸鈉浸泡1 min。用清水清洗3遍種子，并將其放在培養(yǎng)皿中的干燥濾紙上(每個(gè)培養(yǎng)皿放置2層濾紙)。10顆種子胚朝下，并加入4 mL無(wú)菌水，每個(gè)材料做3個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)皿密封后，放入培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，參考琚銘[7]的方法對(duì)材料的發(fā)病等級(jí)進(jìn)行評(píng)估，并將發(fā)病等級(jí)劃分為1、3、5、7、9共5級(jí)。RIL群體鑒定的具體材料數(shù)和重復(fù)如表1所示。

表1 RIL群體表型鑒定的材料數(shù)和重復(fù)Tab.1 Material number and replication for phenotypic investigation of RIL population

1.4 抗性QTL定位分析

RIL群體10條染色體的遺傳圖譜包括207個(gè)SRR(Simple sequence repeat)標(biāo)記位點(diǎn)，圖譜總長(zhǎng)為1 820.8 cM，標(biāo)記平均間距為11.7 cM。采用QTL IciMapping 4.0軟件[12]和完備區(qū)間作圖法，在步長(zhǎng)1 cM、PIN=0.05的參數(shù)下，以2.5為L(zhǎng)OD閾值檢定主效QTL。如果同一染色體不止一個(gè)QTL，則參照MCINTOSH[13]的方法命名，即q+性狀名稱(chēng)縮寫(xiě)+染色體+編號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體種內(nèi)擬輪枝鐮孢菌抗性的表型分析

通過(guò)對(duì)RIL群體4個(gè)環(huán)境的表型數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，種內(nèi)擬輪枝鐮孢菌培養(yǎng)后種子的發(fā)病等級(jí)基本符合正態(tài)分布(圖3)。其中RIL群體的玉米種子對(duì)種內(nèi)擬輪枝鐮孢菌的抗性發(fā)病等級(jí)大部分集中在3～5級(jí)，發(fā)病等級(jí)高于7的高感材料相對(duì)較少，僅有0.94%。

圖3 RIL群體發(fā)病等級(jí)分布Fig.3 Frequency distribution of disease grade in RIL population

對(duì)RIL群體4個(gè)環(huán)境的表型進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)RIL群體的發(fā)病等級(jí)范圍在1～9級(jí)，單環(huán)境的廣義遺傳力在0.84～0.88，聯(lián)合分析的遺傳力為0.74(表2)?？偟膩?lái)說(shuō)遺傳力都相對(duì)較高，說(shuō)明玉米種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌抗性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，主要受遺傳因素控制。

表2 RIL群體4個(gè)環(huán)境表型的描述性統(tǒng)計(jì)Tab.2 Descriptive statistics for RIL population phenotypes in four environments

2.2 玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性的QTL分析

從表3可以看到，4個(gè)環(huán)境共檢測(cè)到10個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于第2、4、6、8、9、10染色體上，解釋2.59%～7.21%的表型變異，其中位于第2染色體上的有3個(gè)QTL。利用4個(gè)環(huán)境表型的最佳無(wú)偏估計(jì)值，對(duì)玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性QTL進(jìn)行聯(lián)合分析。對(duì)RIL群體室內(nèi)表型4次聯(lián)合后共定位到6個(gè)種內(nèi)抗性QTL位點(diǎn)，分別位于第1、3、4、9、10染色體上，解釋的表型變異范圍為1.32%～7.62%。其中，在第3染色體上定位出2個(gè)QTL。在4個(gè)環(huán)境中位于標(biāo)記umc1964—mmc0371的QTL在第1個(gè)環(huán)境及聯(lián)合分析中均被檢測(cè)到，解釋了7.21%的表型變異。在4個(gè)環(huán)境中位于標(biāo)記umc1492—umc1691的QTL在第4個(gè)環(huán)境及聯(lián)合分析中均被檢測(cè)到，解釋了6.64%的表型變異。

表3 4個(gè)環(huán)境中玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性QTL檢測(cè)結(jié)果Fig.3 QTL mapping for maize seed internal Fusarium verticillioides resistance in four environments

效應(yīng)最大的QTL位于第3染色體bnlg1144—bnlg1447，解釋了7.62%的表型貢獻(xiàn)率，抗病效應(yīng)來(lái)自于抗病親本BT-1(圖4)。除此之外，發(fā)現(xiàn)的6個(gè)QTL中，有3個(gè)的抗性來(lái)自于感病親本N6。上述結(jié)果表明，種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性是一個(gè)微效多基因控制的數(shù)量性狀。

圖4 4次聯(lián)合檢測(cè)到的QTL位點(diǎn)在染色體上的分布Fig.4 Chromosomal distribution of QTL detected for seed internal resistance by combined analysis

將上述QTL與課題組前期定位的種子外部對(duì)擬輪枝鐮孢菌抗性QTL[7]進(jìn)行比較(表4)，發(fā)現(xiàn)qSIR4是不同性狀所共有的一致QTL，表明其可能在不同組織均具有對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗病效應(yīng)，說(shuō)明種子內(nèi)部抗性與外部抗性有一定的關(guān)系。qSIR1、qSIR3-1等5個(gè)QTL并未在種子外部抗性定位中檢測(cè)到，說(shuō)明其是種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌抗性的特有QTL，表明種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性具有與外部抗性不同的機(jī)制。

表4 玉米種子內(nèi)部與外部對(duì)擬輪枝鐮孢菌抗性QTL的比較Fig.4 Comparison of QTL results of internal and external resistance of maize seeds to F.verticillioides

3 結(jié)論與討論

擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)能侵染發(fā)育中的玉米籽粒，從而引起玉米穗腐病，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量。當(dāng)人畜食用沒(méi)有癥狀但受真菌侵染的玉米或侵染玉米加工的產(chǎn)品時(shí)，會(huì)攝入真菌毒素，引起中毒、致癌，嚴(yán)重時(shí)甚至致命。研究發(fā)現(xiàn)，玉米種子僅僅表面消毒不能去除內(nèi)部的擬輪枝鐮孢菌，因此有報(bào)道將其稱(chēng)之為種傳真菌[14]。據(jù)報(bào)道，大部分玉米被擬輪枝鐮孢菌無(wú)癥狀侵染，且大多數(shù)的玉米地塊超過(guò)90%的玉米被感染，且無(wú)癥狀感染(內(nèi)部潛伏擬輪枝鐮孢菌)比有癥狀感染(表現(xiàn)為穗腐病、種子干癟等)更普遍[15-19]。由于表面消毒和肉眼挑選等手段無(wú)法解決種內(nèi)潛伏擬輪枝鐮孢菌的問(wèn)題，鑒定優(yōu)異抗源并開(kāi)展遺傳研究，進(jìn)而培育抗擬輪枝鐮孢菌的玉米新品種，對(duì)于阻斷擬輪枝鐮孢菌病害的系統(tǒng)侵染以及保障人畜的健康安全具有重要意義。

課題組在之前進(jìn)行種子抗性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，清水對(duì)照種子進(jìn)行表面消毒后培養(yǎng)，部分材料仍然出現(xiàn)明顯的真菌感染表型，且這種現(xiàn)象并不集中在對(duì)外部真菌抗性較差的遺傳材料上[7]。因此，推測(cè)玉米種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性可能與外部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性并非完全一致。后續(xù)的抗性鑒定表明，大多數(shù)自交系材料對(duì)內(nèi)部攜帶擬輪枝鐮孢菌的抗性表現(xiàn)與外部接種時(shí)的抗性相比，并不完全一致。因此，課題組將種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性作為一個(gè)獨(dú)立的性狀并開(kāi)展抗性遺傳研究。

采用果穗大田預(yù)接種，收獲后選取無(wú)穗腐癥狀種子，表面消毒后恒溫培養(yǎng)，對(duì)玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性進(jìn)行鑒定。以玉米骨干自交系BT-1和N6為親本構(gòu)建的RIL群體為材料，通過(guò)4個(gè)環(huán)境的聯(lián)合分析，檢測(cè)到6個(gè)控制玉米種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌抗性的QTL位點(diǎn)，分別位于第1、3、4、9、10染色體上。琚銘[7]利用同一套R(shí)IL群體對(duì)玉米種子進(jìn)行接種后鑒定，定位到8個(gè)種子外部抗性QTL，其中第4染色體上的QTL與本研究一致。上述結(jié)果表明，玉米種子內(nèi)部對(duì)擬輪枝鐮孢菌的抗性是獨(dú)立的性狀。

數(shù)量性狀由微效多基因控制，往往效應(yīng)較小且容易受環(huán)境影響。通過(guò)4個(gè)環(huán)境的聯(lián)合分析定位到6個(gè)QTL，表型貢獻(xiàn)率在1.32%～7.62%。SSR分子標(biāo)記遺傳圖譜定位的QTL區(qū)間較大，因此，下一步需要進(jìn)一步擴(kuò)大定位群體，增加環(huán)境數(shù)量，提高遺傳圖譜的標(biāo)記密度，以增加定位的精度。在此基礎(chǔ)上克隆抗病QTL，加深對(duì)抗病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為抗病遺傳育種工作奠定基礎(chǔ)。