祿亞洲，李 寧，張二豪2,，尹 秀2,，趙墾田，蘭小中2,

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 高原生態(tài)研究所，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院-西南大學(xué)藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心，西藏 林芝 860000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；4.西藏農(nóng)牧學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，西藏 林芝 860000)

多年生草本藏藥甘青青蘭(DracocephalumtanguticumMaxim.)是唇形科(Labiatae)青蘭屬(Dracocephalum)植物，別稱為則羊古或唐古特青蘭，主要分布在甘肅、青海、西藏及四川等地區(qū)[1-4]，生長(zhǎng)在叢林林緣、山野路旁、高山草地、草灘、干燥河谷兩岸等海拔為1 999～4 600 m的地方[5]，具有熱胃清肝、祛濕清熱、解表疏風(fēng)、和胃舒肝和止血等功效[6-7]。

隨著全球環(huán)境變化，干旱問(wèn)題日益突出[8]，成為限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一[9-10]。干旱不僅導(dǎo)致植物葉片水勢(shì)下降、氣孔關(guān)閉、光合速率降低，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體因缺水而死亡[11]。因此，提高植物抗旱能力對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著重要意義。

植物體內(nèi)內(nèi)源激素水楊酸(Salicylic acid，SA)能夠促進(jìn)植物體內(nèi)一系列抗性防御反應(yīng)[12]。研究表明，在逆境條件下適宜濃度的SA溶液處理能提高植物的抗逆能力且能提升植物種子的萌發(fā)特性[13-17]，減緩植物機(jī)體內(nèi)可溶性蛋白含量的下降速度，使植物葉片中葉綠素和可溶性糖含量增加，抗氧化系統(tǒng)的酶活性增強(qiáng)，水分利用率提高[18-21]。目前，有關(guān)SA浸種對(duì)藏藥甘青青蘭種子萌發(fā)及幼苗抗旱性的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，研究不同濃度SA浸種對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)特性的影響，待幼苗長(zhǎng)至兩葉期以PEG-6000作為干旱脅迫的滲透劑，對(duì)甘青青蘭幼苗期進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，并研究適宜濃度SA浸種對(duì)干旱脅迫下甘青青蘭幼苗抗旱能力的影響，以期獲得能夠提高甘青青蘭種子萌發(fā)率和幼苗抗旱能力的最佳SA濃度，為藏藥甘青青蘭的人工栽培提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以西藏農(nóng)牧學(xué)院藏藥材種質(zhì)資源圃繁育的甘青青蘭種子為試驗(yàn)材料，選取顆粒飽滿的種子，用0.5%次氯酸鈉溶液消毒2 min，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，風(fēng)干備用。

1.2 方法

1.2.1 SA浸種對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

1.2.1.1 SA浸種處理 挑選50粒經(jīng)消毒處理的甘青青蘭種子，設(shè)置SA濃度為0(蒸餾水處理，CK)、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，每個(gè)濃度處理設(shè)置3次重復(fù)。用上述5種濃度SA溶液對(duì)甘青青蘭種子浸種24 h，棄去SA溶液，用蒸餾水沖洗3～5次，待種子晾干后置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光周期為16 h/8 h，日間溫度為20 ℃，夜間溫度為15 ℃。每天于同一時(shí)間段向培養(yǎng)皿中添加定量的蒸餾水，以便保持濾紙的潤(rùn)濕程度不變。

1.2.1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法 從培養(yǎng)當(dāng)天開(kāi)始，每隔1 d記錄每個(gè)培養(yǎng)皿中種子的萌發(fā)數(shù)，待種子萌發(fā)率保持不變，萌發(fā)進(jìn)程結(jié)束。種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[22-24]。

1.2.2 SA浸種對(duì)甘青青蘭幼苗抗旱性的影響試驗(yàn)

1.2.2.1 PEG-6000水分脅迫處理 經(jīng)1.2.1數(shù)據(jù)分析篩選出有助于甘青青蘭種子萌發(fā)的SA最佳浸種濃度，用最佳濃度SA浸泡甘青青蘭種子24 h，同時(shí)以蒸餾水處理作對(duì)照(CK)，在甘青青蘭幼苗長(zhǎng)勢(shì)基本一致且長(zhǎng)至2片完全葉時(shí)用20% PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，3次重復(fù)。

1.2.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 在干旱脅迫第0、1、2、3 天分別測(cè)定甘青青蘭葉片丙二醛、游離脯氨酸、可溶性蛋白、葉綠素含量。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定[25]；游離脯氨酸含量采用磺基SA法測(cè)定[26]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[27]；葉綠素含量采用乙醇提取比色法測(cè)定[28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA浸種對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)的影響

2.1.1 萌發(fā)進(jìn)程 由圖1可見(jiàn)，培養(yǎng)第3天,不同處理甘青青蘭種子均開(kāi)始萌發(fā)，其中不同濃度SA浸種處理萌發(fā)緩慢，隨著萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，CK和不同濃度SA浸種處理種子發(fā)芽率迅速增加，且萌發(fā)后期SA浸種處理種子發(fā)芽率高于CK，培養(yǎng)第15天甘青青蘭種子萌發(fā)進(jìn)程結(jié)束，發(fā)芽率達(dá)到最大值。SA浸種處理中0.6 mmol/L SA浸種24 h，萌發(fā)第15天時(shí)，甘青青蘭種子發(fā)芽率最大，為54.44%，顯著高于CK(發(fā)芽率為40.38%)。

不同小寫字母表示同一時(shí)間差異顯著(P<0.05The different small letters within the same time mean significant difference(P<0.05圖1 不同濃度SA浸種甘青青蘭種子的萌發(fā)進(jìn)程Fig.1 The germination process of Dracocephalum tanguticum Maxim.seeds soaked by different concentrations of SA

2.1.2 萌發(fā)特性 由表1可見(jiàn)，適宜濃度SA溶液浸種均可以提高甘青青蘭種子的發(fā)芽率，但增加幅度各不相同。0.6 mmol/L SA浸種24 h，甘青青蘭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于其他濃度SA浸種處理和CK，其中，較CK分別顯著提高34.82%、34.42%、34.87%和54.86%。因此，在甘青青蘭種子萌發(fā)時(shí)建議采用0.6 mmol/L SA浸種24 h的方法處理種子。

2.2 SA浸種對(duì)甘青青蘭幼苗抗旱性的影響

2.2.1 丙二醛含量 丙二醛含量可以間接反映干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害程度。由圖2可見(jiàn)，隨干旱脅迫時(shí)間的增加，0.6 mmol/L SA溶液浸種處理和CK甘青青蘭幼苗丙二醛含量增多。相同脅迫時(shí)間，0.6 mmol/L SA溶液浸種處理甘青青蘭幼苗的丙二醛含量顯著低于CK。干旱脅迫第3天，CK甘青青蘭幼苗丙二醛含量是0.6 mmol/L SA溶液浸種處理的1.11倍，0.6 mmol/L SA浸種處理可以減少丙二醛的累積，增強(qiáng)幼苗抗旱能力。

表1 不同濃度SA浸種處理甘青青蘭種子的萌發(fā)情況Tab.1 The germination of Dracocephalum tanguticum Maxim.seeds soaked by different concentrations of SA

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。
Note:The different small letters within the same column mean significant difference(P<0.05).

圖2 0.6 mmol/L SA浸種對(duì)干旱脅迫條件下甘青青蘭幼苗丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on the MDA content of Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

2.2.2 游離脯氨酸含量 由圖3可見(jiàn)，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CK植株中游離脯氨酸含量呈先增高后降低的趨勢(shì)，0.6 mmol/L SA溶液浸種處理植株游離脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)。0.6 mmol/L SA浸種處理甘青青蘭幼苗游離脯氨酸含量顯著高于CK。干旱脅迫第3天，SA溶液浸種處理植株體內(nèi)游離脯氨酸含量是CK的3.25倍，說(shuō)明SA浸種處理可以促進(jìn)游離脯氨酸在植物體中的累積，從而提高植株的抗旱能力。

圖3 0.6 mmol/L SA浸種對(duì)干旱脅迫下甘青青蘭幼苗游離脯氨酸含量的影響Fig.3 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on free proline content of Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

2.2.3 可溶性蛋白含量 由圖4可以看出，隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，CK和0.6 mmol/L SA浸種處理的植株中可溶性蛋白含量均呈下降趨勢(shì)。干旱脅迫過(guò)程中，CK和0.6 mmol/L SA浸種處理甘青青蘭幼苗中可溶性蛋白含量無(wú)顯著差異，表明 SA浸種處理對(duì)甘青青蘭幼苗的可溶性蛋白含量無(wú)明顯影響。

2.2.4 葉綠素含量 由圖5可見(jiàn)，0.6 mmol/L SA浸種處理對(duì)甘青青蘭幼苗葉片葉綠素含量產(chǎn)生一定程度的影響。隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，0.6 mmol/L SA浸種處理和CK葉綠素a和葉綠素b含量均呈下降趨勢(shì)，葉綠素a/b逐漸增大，干旱脅迫第3天，0.6 mmol/L SA浸種處理與CK的葉綠素a、b含量及葉綠素a/b無(wú)顯著差異，表明 SA浸種處理對(duì)甘青青蘭幼苗的葉綠素含量無(wú)明顯影響。0.6 mmol/L SA浸種處理和CK幼苗葉片中葉綠素a和葉綠素b含量以及葉綠素a/b的變化規(guī)律一致。

圖4 0.6 mmol/L SA浸種對(duì)干旱脅迫下甘青青蘭幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on soluble protein content of Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

圖5 0.6 mmol/L SA浸種對(duì)干旱脅迫下甘青青蘭幼苗葉綠素a、b含量和葉綠素a/b的影響Fig.5 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on chlorophyll a,b content and a/b in Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

3 結(jié)論與討論

植物在逆境下，膜脂往往會(huì)發(fā)生過(guò)氧化作用，其分解產(chǎn)物丙二醛的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[29]。本研究中，隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，0.6 mmol/L SA浸種處理和CK(未經(jīng)SA浸種處理)甘青青蘭幼苗中丙二醛含量均逐漸升高，但SA浸種處理幼苗中丙二醛含量低于CK?？赡苁荢A浸種處理減少了干旱脅迫下丙二醛的積累，阻止交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生，緩解膜脂過(guò)氧化作用，進(jìn)而減輕干旱脅迫對(duì)甘青青蘭幼苗的傷害。

大量研究表明，逆境條件下植物體內(nèi)游離脯氨酸含量增加，脯氨酸積累有利于提高細(xì)胞滲透勢(shì)，增強(qiáng)缺水時(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減輕逆境對(duì)細(xì)胞的損害作用[30]。本研究中，干旱脅迫下，0.6 mmol/L SA浸種處理甘青青蘭幼苗中游離脯氨酸含量高于CK，減輕了干旱對(duì)葉片細(xì)胞的傷害作用。

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量提高，是其適應(yīng)逆境脅迫的一種應(yīng)答反應(yīng)，因此，可溶性蛋白含量可作為檢測(cè)植物抗逆能力的一個(gè)指標(biāo)[31]。一般認(rèn)為，可溶性蛋白含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)相應(yīng)升高，但也有研究表明，水分脅迫下可溶性蛋白含量呈下降趨勢(shì)[32]。本研究中，0.6 mmol/L SA浸種處理和CK甘青青蘭幼苗中可溶性蛋白含量隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，且二者差異不明顯，表明甘青青蘭的抗旱能力相對(duì)較弱。

葉綠素在光合反應(yīng)中起著重要作用，主要參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化[33]。水分脅迫會(huì)造成植物葉綠素含量降低，故葉綠素含量變化是植物遭受傷害程度的一種反映[34]，葉綠素a/b增大，可能是植物對(duì)逆境的一種防御性反應(yīng)[35]。本研究中，隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，0.6 mmol/L SA浸種處理和CK甘青青蘭幼苗中葉綠素a/b比值均呈上升趨勢(shì)，表明甘青青蘭可以通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)葉綠素含量來(lái)抵御干旱脅迫對(duì)自身的傷害。

在本試驗(yàn)中，0.6 mmol/L SA浸種24 h甘青青蘭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，說(shuō)明適宜濃度SA浸種可以促進(jìn)甘青青蘭種子萌發(fā)，0.6 mmol/L為甘青青蘭的最佳SA浸種濃度。干旱脅迫下0.6 mmol/L SA浸種和CK甘青青蘭幼苗中可溶性蛋白含量均呈下降趨勢(shì)，葉綠素a/b均呈上升趨勢(shì)，表明甘青青蘭為一種抗旱能力比較弱的植物；0.6 mmol/L SA浸種24 h甘青青蘭幼苗的丙二醛含量低于CK，游離脯氨酸含量高于CK，說(shuō)明0.6 mmol/L SA浸種24 h可以提升甘青青蘭幼苗的抗旱能力。