胡風(fēng)越，王克劍

前沿聚焦

STEME系統(tǒng)：一種助力體內(nèi)定向進(jìn)化的新工具

胡風(fēng)越，王克劍

中國(guó)水稻研究所，水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006

通過定向進(jìn)化(directed evolution)可以快速進(jìn)行蛋白工程改良及重要基因功能研究，以獲得新型農(nóng)藝性狀突變體。近期，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)和李家洋團(tuán)隊(duì)合作構(gòu)建了新型的飽和靶向內(nèi)源誘變編輯器(saturated targeted endogenous mutagenesis editors, STEMEs)，并在植物中實(shí)現(xiàn)了基因的定向進(jìn)化和功能篩選。該系統(tǒng)融合了現(xiàn)有的2種單堿基編輯技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)在植物體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)C:G>T:A、A:T>G:C雙堿基編輯，通過靶向羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域編碼序列定向進(jìn)化出水稻除草劑抗性植株。這種在體內(nèi)進(jìn)行基因定向進(jìn)化的新方法，對(duì)于今后農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀的篩選和功能基因研究具有重要作用。本文對(duì)STEME系統(tǒng)的組成、編輯效率和應(yīng)用原理進(jìn)行介紹，并與已有的定向進(jìn)化方法進(jìn)行比較，為加速作物種質(zhì)資源創(chuàng)新研究提供參考。

STEME；雙堿基編輯；定向進(jìn)化；種質(zhì)創(chuàng)新

育種是通過改變遺傳信息進(jìn)而篩選獲得具有優(yōu)良性狀的生物材料的過程。相較于傳統(tǒng)的通過物理(如紫外線)、化學(xué)(如甲烷磺酸乙酯)誘變產(chǎn)生隨機(jī)突變的方式，定向進(jìn)化(directed evolution)技術(shù)具有靶向誘導(dǎo)變異、進(jìn)化周期短和勞動(dòng)節(jié)約型等優(yōu)勢(shì)[1]，因此在植物種質(zhì)創(chuàng)新研究中頗具潛力。

目前，定向進(jìn)化方法多用于蛋白工程改良[3]，且常需借助大腸桿菌、酵母等進(jìn)行體外培養(yǎng)。這些方法包括誘導(dǎo)產(chǎn)生隨機(jī)突變的epPCR (error-prone PCR)、位點(diǎn)飽和突變(site saturation mutagenesis)技術(shù)和基于基因重組的DNA shuffling、StEP重組(staggered extension process)等技術(shù)。然而，這種脫離原始基因組和細(xì)胞環(huán)境的體外培養(yǎng)方式并不能完全表現(xiàn)突變基因的重要性狀及功能[4]。近年來，CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein)基因編輯系統(tǒng)的快速發(fā)展為創(chuàng)制作物新品種提供了一種更加高效的技術(shù)手段，也為高等真核生物體內(nèi)定向進(jìn)化研究打開了大門。2019年，Butt等[5]搭建了誘變和選擇相結(jié)合的CRISPR/Cas定向進(jìn)化平臺(tái)(CRISPR/Cas- directed evolution, CDE)，在水稻中成功創(chuàng)制出抗GEX1A剪接抑制劑的轉(zhuǎn)錄組核心剪接因子突變株，實(shí)現(xiàn)了植物體內(nèi)重要性狀的定向進(jìn)化和以結(jié)構(gòu)域?yàn)橹行牡牡鞍锥ㄏ蜻M(jìn)化。但是，利用CRISPR/ Cas9產(chǎn)生的突變絕大多數(shù)都是插入和缺失，造成移碼突變或無(wú)義突變，常常導(dǎo)致蛋白功能喪失甚至植株死亡[6]，不能應(yīng)用于研究其他突變類型與基因功能、農(nóng)藝性狀之間的關(guān)系。

近期，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)和李家洋團(tuán)隊(duì)合作設(shè)計(jì)了可以從頭突變并促進(jìn)植物定向進(jìn)化的飽和靶向內(nèi)源誘變編輯器(saturated targeted endogenous mutagenesis editors, STEMEs)[7]，作為加快植物和作物性狀發(fā)展與進(jìn)化的平臺(tái)，為快速獲得新的優(yōu)良農(nóng)藝性狀提供了可能。

1 STEME系統(tǒng)有效實(shí)現(xiàn)C:G>A:T和A:T>G:C雙堿基編輯

單堿基編輯是基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的可實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基精準(zhǔn)替換的基因編輯工具，即在不產(chǎn)生基因組DNA雙鏈斷裂的情況下，利用胞嘧啶脫氨酶或人工進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的單堿基轉(zhuǎn)變。此前，多個(gè)課題組已經(jīng)在植物中成功構(gòu)建了誘導(dǎo)胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變的胞嘧啶堿基編輯器(cytidine base editors, CBEs)，以及A向G轉(zhuǎn)換的腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABEs)[8]。單堿基編輯器的發(fā)展為STEME系統(tǒng)的建立奠定了基礎(chǔ)。

第一代STEME雙堿基編輯系統(tǒng)是基于植物A3A-PBE[14](一種CBE系統(tǒng))和PABE-7[16](一種ABE系統(tǒng))，將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時(shí)融合在nCas9(D10A)的N端，并將尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)以融合或自由表達(dá)的形式置于nCas9(D10A)的C端構(gòu)建形成。其所包含的4種組合形式STEME-1、STEME-2、STEME-3和STEME-4，均能在一個(gè)sgRNA(single guide RNA)的引導(dǎo)下誘導(dǎo)C:G>T:A和A:T>G:C同時(shí)突變，顯著增加突變和功能遺傳的多樣性。其中，各元件以5'- APOBEC3A-ecTadA-ecTadA7.10-nCas9(D10A)-UGI-3'方式組合的STEME-1的編輯效果最佳。此外，由于第一代STEME系統(tǒng)STEME-1僅識(shí)別原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)為NGG的序列，第二代STEME系統(tǒng)在STEME-1的基礎(chǔ)上將nCas9 (D10A)換成nCas9-NG (D10A)，形成STEME-NG，識(shí)別PAM為NG的序列，極大地?cái)U(kuò)展了靶基因的可編輯范圍。

同時(shí)，該研究比較了雙堿基編輯器STEME與胞嘧啶堿基編輯器A3A-PBE、腺嘌呤堿基編輯器PABE-7各自的誘變效率。在水稻原生質(zhì)體中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：STEME-1系統(tǒng)對(duì)C:G>T:A的單堿基誘導(dǎo)效率(平均25.14%)比A3A-PBE系統(tǒng)(平均17.25%)高約1.5倍，STEME-1系統(tǒng)對(duì)C:G>T:A的誘導(dǎo)效率最高達(dá)61.61%；STEME-1系統(tǒng)對(duì)A:T>G:C的單堿基誘導(dǎo)效率(0.69%~15.50%)比PABE-7系統(tǒng)(1.74%~ 21.57%)略低；而STEME-1系統(tǒng)對(duì)C:G>T:A和A:T> G:C的雙堿基編輯效率為0.49%~15.10%，這已足以為改進(jìn)的定向進(jìn)化策略提供所需的突變多樣性。所以，STEME系統(tǒng)是非常有效且靶向廣泛的雙堿基編輯系統(tǒng)，為實(shí)現(xiàn)靶基因的近飽和突變提供可能。

2 STEME系統(tǒng)加速新品種創(chuàng)制和作物工程研究

在建立STEME系統(tǒng)之后，研究人員利用該系統(tǒng)進(jìn)行定向進(jìn)化水稻抗除草劑新種質(zhì)的研究。定向進(jìn)化工作主要包括以下6個(gè)步驟[5]：(1)基于PAM序列要求，設(shè)計(jì)針對(duì)基因整個(gè)編碼序列的所有可能的sgRNAs；(2)通過Oligo合成和退火產(chǎn)生sgRNAs文庫(kù)；(3)將sgRNAs分別構(gòu)建到雙元載體上；(4)雙元載體質(zhì)粒按照等摩爾比進(jìn)行混池，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染水稻愈傷；(5)經(jīng)潮霉素篩選及目標(biāo)藥物篩選獲得穩(wěn)定的抗性愈傷組織，繼續(xù)在選擇壓力下再生抗性幼苗；(6)對(duì)抗性幼苗及子代進(jìn)行詳細(xì)的基因型分析和表型分析，鑒定蛋白變異類型。利用STEME-NG系統(tǒng)，研究者設(shè)計(jì)了20個(gè)sgRNA覆蓋基因上編碼羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的168 bp堿基序列。在水稻原生質(zhì)體中，該系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的堿基突變類型和平均堿基編輯效率為C>T (11.50%)、A>G (0.35%)、G>A (13.33%)、T>C (0.45%)，相比A3A-PBE-NG載體，突變多樣性顯著增加。此外，168 bp序列編碼的56個(gè)氨基酸中有41個(gè)氨基酸發(fā)生多種類型的突變(無(wú)義突變、錯(cuò)義突變和沉默突變)，氨基酸突變率高達(dá)73.21%，實(shí)現(xiàn)了近似飽和誘變。隨后，研究者綜合應(yīng)用STEME-1和STEME-NG系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了200個(gè)sgRNA靶向羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域上400個(gè)氨基酸編碼序列，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)技術(shù)形成抗性愈傷組織，在高效氟吡甲禾靈(haloxyfop)篩選條件下成功獲得抗除草劑幼苗。值得一提的是，周煥斌團(tuán)隊(duì)[17]和魏鵬程團(tuán)隊(duì)[18]同樣基于單堿基編輯系統(tǒng)，分別在水稻中近似飽和誘變除草劑靶標(biāo)基因全長(zhǎng)編碼區(qū)和基因羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié) 構(gòu)域編碼序列，成功定向進(jìn)化出水稻抗除草劑優(yōu)良種質(zhì)。

3 STEME系統(tǒng)與其他植物體內(nèi)定向進(jìn)化方法的比較

突變多樣性的構(gòu)建是植物蛋白工程的基礎(chǔ)。其中，運(yùn)用較多的突變文庫(kù)構(gòu)建方式為epPCR、位點(diǎn)飽和突變和DNA shuffling[19~22]，廣泛應(yīng)用于獲得除草劑(如草甘膦)抗性[23]、提升光合作用效率[24]、生物降解[25]等酶工程改造(表1對(duì)部分植物定向進(jìn)化突變多樣性構(gòu)建方法進(jìn)行了比較)。STEME可在高等真核生物體內(nèi)進(jìn)行靶向誘變，這彌補(bǔ)了以往植物蛋白體內(nèi)誘變方法的缺陷[26]。此外，相較于其他植物體內(nèi)定向進(jìn)化方法，STEME系統(tǒng)還具有以下突出 優(yōu)勢(shì)：

(1)一步實(shí)現(xiàn)近似飽和誘變，減少篩選次數(shù)，有效避免有害突變的積累。目前用于植物定向進(jìn)化的方法依賴PCR技術(shù)，需要經(jīng)多輪循環(huán)積累突變多樣性，并通過篩選來剔除不必要的有害突變和中性突變，以提升突變文庫(kù)質(zhì)量，再進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化到異種宿主中的突變體進(jìn)行功能篩選。因此，傳統(tǒng)的定向進(jìn)化方法往往需要多步篩選，操作繁瑣。相反，STEME系統(tǒng)的運(yùn)用僅需要將其導(dǎo)入植物原生質(zhì)體或愈傷組織中，一次轉(zhuǎn)化即實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)同時(shí)編輯多位點(diǎn)，無(wú)需重復(fù)編輯，避免了有害突變的積累。

(2)在體內(nèi)誘變產(chǎn)生突變文庫(kù)為轉(zhuǎn)化效率低的物種提供一個(gè)可行的選擇。傳統(tǒng)的定向進(jìn)化方法需要在體外構(gòu)建突變文庫(kù)，再轉(zhuǎn)化至異種細(xì)胞中進(jìn)行篩選。然而，Engqvist等[26]曾表示植物蛋白工程定向進(jìn)化面臨著轉(zhuǎn)化率低的問題，改進(jìn)現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化方法或開發(fā)新的轉(zhuǎn)化方法將是擴(kuò)大植物蛋白工程應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，CRISPR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種植物，有效編輯芽、根或子葉等多種組織中的基因組[27,28]，為轉(zhuǎn)化效率低的問題提供了一個(gè)解決方案。STEME系統(tǒng)基于CRISPR技術(shù)，直接在植物體內(nèi)誘導(dǎo)突變，有效降低了突變文庫(kù)的轉(zhuǎn)化損失。

表1 部分植物定向進(jìn)化突變文庫(kù)構(gòu)建方法的介紹與比較

4 結(jié)語(yǔ)與展望

傳統(tǒng)的植物育種方式可能已經(jīng)無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的糧食需求和環(huán)境挑戰(zhàn)，基因編輯技術(shù)的發(fā)展正逐步為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提供可預(yù)測(cè)、精準(zhǔn)、快速的育種技術(shù)手段。STEME雙堿基編輯系統(tǒng)的建立拓展了植物堿基突變多樣性，加速農(nóng)作物新種質(zhì)創(chuàng)制和功能蛋白的定向進(jìn)化。未來，我們期待能夠在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化該快速定向進(jìn)化系統(tǒng)，如效率更高、更穩(wěn)定，或識(shí)別更多的PAM類型以擴(kuò)大靶向范圍，或同時(shí)實(shí)現(xiàn)12種類型的堿基轉(zhuǎn)變、小范圍插入或缺失與堿基編輯的組合突變以增加突變多樣性。同時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的遞送困難也是農(nóng)業(yè)中采用CRISPR/ Cas基因組編輯技術(shù)的一個(gè)瓶頸。研究證明，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化傳遞sgRNAs所產(chǎn)生的突變多樣性不如粒子攻擊方法所產(chǎn)生的突變多樣性[17]，且傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方式耗時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)密集，容易產(chǎn)生隨機(jī)的體細(xì)胞突變，這些都降低了CRISPR工具原本能產(chǎn)生的效應(yīng)[33]。因此有必要優(yōu)化傳遞方法，最大限度地將包含sgRNA文庫(kù)的CRISPR復(fù)合物轉(zhuǎn)化到植物中，充分提高各種作物的轉(zhuǎn)化效率。綜上所述，真核生物體內(nèi)定向進(jìn)化的大門已經(jīng)打開，隨著CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)展完善或其他新的技術(shù)的崛起，這一領(lǐng)域?qū)⒌玫礁彀l(fā)展，加速種質(zhì)資源創(chuàng)新與應(yīng)用的步伐。

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The STEME system: a novel tool for directed evolution

Fengyue Hu, Kejian Wang

Directed evolution can be rapidly applied for engineering proteins, studying gene functions, and obtaining mutants with important agronomic traits. Recently, Caixia Gao and Jiayang Li’s team from the Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, worked together to engineer novel saturated targeted endogenous mutagenesis editors (STEMEs), realizingdirected evolution and function selection in plants. This system integrated the existing two single-base editing techniques, successfully induced C:G>T:A and A:T>G:C double-base editing in plants, and artificially evolved into herbicide-resistant rice through targeting thecarboxyltransferase domain coding sequence. This new method of gene directed evolutiondisplays great application potential in important agronomic trait screening and plant functional gene researches. Here we introduce the composition, editing efficiency, and application principle of the STEME system, and compare it with the existing directed evolution methods, so as to provide a reference for accelerating the innovation of crop germplasm resources.

STEME; double base editing; directed evolution; germplasm innovation

2020-02-17;

2020-02-26

國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)(編號(hào)：2019ZX08010-003)資助 [Supported by the National Transgenic Science and Technology Program (No. 2019ZX08010-003)]

胡風(fēng)越，碩士研究生，專業(yè)方向：作物種質(zhì)資源學(xué)。E-mail: hufy_caas@163.com

王克劍，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用。E-mail: wangkejian@caas.cn

10.16288/j.yczz.20-041

2020/2/29 11:04:42

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200228.1149.004.html

(責(zé)任編委: 韓玉波)