賈小平，桑璐曼，王振山，趙 淵，張小梅，李劍峰，張 博，周俊超

(河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程受到很多環(huán)境因素的影響，在其進(jìn)化過程中逐漸形成了對(duì)環(huán)境信號(hào)做出敏銳反應(yīng)的能力[1]。光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可或缺的環(huán)境信號(hào)。植物會(huì)通過獨(dú)特的光合作用(Photosynthesis)與周圍環(huán)境進(jìn)行著物質(zhì)和能量的交換，以維持其正常的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。光周期(Photoperiod)即晝/夜交替周期，在地球上各緯度地帶季節(jié)性交替循環(huán)，植物對(duì)這種規(guī)律性變化的日照時(shí)間長(zhǎng)短往往會(huì)表現(xiàn)出有規(guī)律的生長(zhǎng)發(fā)育現(xiàn)象，稱為光周期現(xiàn)象(Photoperiodism)，不同的植物對(duì)光周期的敏感性是不同的[3-4]。抽穗開花是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中非常重要的階段，主要是由植物的感光性、感溫性和基本營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)性所決定，近些年相關(guān)研究者提出了光周期途徑、自主調(diào)節(jié)途徑、赤霉素途徑和春化途徑這4種開花調(diào)控途徑[5]。其中光周期是植物開花的主要環(huán)境決定因素，一些熱帶種質(zhì)在長(zhǎng)日照條件下可以顯著延遲生殖生長(zhǎng)的開始，因此，光周期現(xiàn)象也被視為一種重要的生理特征[6-7]。目前對(duì)光周期途徑的研究較徹底，如通過水稻抽穗期的遺傳學(xué)分析、QTL定位及相關(guān)基因克隆等基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，抽穗期受多個(gè)基因調(diào)控，而Hd3a(Heading date 3a)基因是所有調(diào)控路徑的末端基因，其表達(dá)量的高低直接與抽穗期早晚緊密相關(guān)，并且受光周期調(diào)控，在短日照條件下表達(dá)量增加，而在長(zhǎng)日照條件下表達(dá)量較低，Hd3a基因表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律性表達(dá)特點(diǎn)，同時(shí)植物的生理過程也表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，從而能夠適應(yīng)環(huán)境的晝夜循環(huán)[8-9]。

谷子是短日照喜溫作物，其中光周期是影響其生態(tài)適應(yīng)性的關(guān)鍵因素，這種生態(tài)適應(yīng)性主要是通過調(diào)節(jié)抽穗期來實(shí)現(xiàn)的。作為一種C4作物，谷子中關(guān)于光周期調(diào)控開花的基因極少報(bào)道[10]，目前谷子全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，這為克隆光周期途徑抽穗、開花控制基因提供了基礎(chǔ)。鑒于成花素基因Hd3a是水稻抽穗期的直接調(diào)控者，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆谷子成花素基因SiHd3a，在進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，研究該基因在長(zhǎng)、短日照條件下的晝夜表達(dá)規(guī)律，揭示其在調(diào)控谷子抽穗過程中所起的作用，為進(jìn)一步深入研究谷子光周期敏感性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為谷子地方品種黃毛谷，來源于河北，具有對(duì)光周期非常敏感的特性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 谷子的種植和取樣 選取籽粒飽滿的黃毛谷種子點(diǎn)播于營(yíng)養(yǎng)土中，置于光照培養(yǎng)箱，晝夜溫度30 ℃/25 ℃，待長(zhǎng)至四葉期分別進(jìn)行2種不同光周期處理：短日照處理(9 h光/15 h暗)、長(zhǎng)日照處理(15 h光/9 h暗)。統(tǒng)一早上6：00開始光照，分別于15：00和21：00進(jìn)入黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)21 d，在晝夜24 h內(nèi)從晚上21：00開始取樣，每隔3 h取1次，共取9次樣(21：00取樣2次)，每次均取頂端第1片幼葉，所取葉片均在液氮速凍后置-70 ℃保存，用于總 RNA 的提取。

1.2.2 谷子總RNA的提取與第一鏈cDNA 的合成 用康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司的OmniPlant RNA Kit提取葉片總RNA。用寶生物公司(TaKaRa)的DNase 處理各樣品總RNA，去除殘留的基因組DNA，參照寶生物公司的PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書以總RNA為模板，用 Oligo(dT18)及6堿基隨機(jī)引物(Random hexamers)合成第一鏈 cDNA，于-20 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 利用生物信息學(xué)方法以水稻Hd3a基因(登錄號(hào)：AB052941)編碼蛋白質(zhì)序列為查詢序列，對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)phtozome(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中的谷子基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行 Blast同源搜索，獲得谷子4號(hào)染色體的成花素基因序列(Seita.4G067600)，命名為SiHd3a。根據(jù)此序列，用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物：正向引物為5′-CCAAGCAAGGCTACAGGT-3′，反向引物為5′-GTGGCTAGTGTGTCGTACT-3′；預(yù)期擴(kuò)增片段大小為792 bp，包含完整的CDS區(qū)域。

PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 10.5 μL，2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1.0 μL。擴(kuò)增循環(huán)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收純化目標(biāo)片段。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序 將回收純化的基因片段連接到pMD18-T載體(寶生物公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化有限公司)。挑取陽(yáng)性菌落，移入裝有1 mL無菌液體 LB 培養(yǎng)基(含Amp 50 mg/L)的1.5 mL滅菌離心管中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h后，用M13引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。菌液PCR擴(kuò)增體系為20 μL，含2 μL 10×Buffer、1.6 μL 2.5 mmol/L的dNTPs、1.6 μL 25 mmol/L MgCl2、0.6 μL 10 pmol/μL的正反向引物、1 μL菌液、0.4 μLTaq酶、12.2 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；隨后94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后拍照，將檢測(cè)正確的陽(yáng)性克隆菌液送往生工(上海)有限公司測(cè)序部測(cè)序。

1.2.6SiHd3a基因生物信息學(xué)分析 用ProtParam在線工具(https：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本物理化學(xué)性質(zhì)；用 SOPMA和Swiss-model在線分析軟件(http：//www.sopma.org/，https：//swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用CELLO在線工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；將SiHd3a蛋白序列作為查詢序列，通過Blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序同源搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得部分物種Hd3a蛋白同源序列，用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.7SiHd3a基因半定量PCR分析 設(shè)計(jì)SiHd3a基因半定量擴(kuò)增引物：SiHd3aRT-F為5′-AAGTTGCGACGAGATGGC-3′，SiHd3aRT-R為5′-GCGAAGTCCCTGGTGTTGA-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物459 bp。以谷子SiActin基因作為對(duì)照，引物序列：SiActin-F為5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′，SiActin-R為5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′；產(chǎn)物大小為228 bp[11]。

通過摸索得到半定量 PCR 反應(yīng)最佳循環(huán)程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，28 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子總RNA的提取

分別在長(zhǎng)日照、短日照條件下培養(yǎng)谷苗，取21 d的頂端幼嫩葉片提取總RNA，結(jié)果見圖1，可以看出，所提取的RNA完整性較好。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并用作模板擴(kuò)增內(nèi)參基因，結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期一致的228 bp的條帶，證明cDNA合成成功(圖2)。

1，2.提取的2管RNA。

M.Marker DL2000；1，2.內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 谷子SiHd3a基因擴(kuò)增與菌液PCR檢測(cè)

以 cDNA為模板擴(kuò)增SiHd3a基因，結(jié)果見圖3，可以看出，在靠近750 bp處擴(kuò)增出一條特異性條帶，與預(yù)期的792 bp接近。通過連接、轉(zhuǎn)化得到單克隆，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，獲得了與預(yù)期條帶一致的目的片段(圖4)，將檢測(cè)成功的陽(yáng)性克隆菌液送生工上海生物技術(shù)公司測(cè)序。

M.Marker DL2000；1.RT-PCR產(chǎn)物。

M.Marker DL2000；1-3.3管菌液。

2.3 谷子SiHd3a基因的序列分析

通過測(cè)序得到谷子SiHd3a的cDNA序列，如圖5所示。序列分析表明，該基因cDNA序列大小為792 bp，包含完整的CDS序列537 bp，編碼178個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)豫谷1號(hào)基因序列進(jìn)行比對(duì)，只有3個(gè)堿基突變，分別位于豫谷1號(hào)SiHd3a基因序列的38，144，218 bp處，對(duì)應(yīng)黃毛谷SiHd3a基因cDNA序列的32，138，212 bp處(圖6)。其中第1處突變位于編碼區(qū)外，第2處突變使豫谷1號(hào)SiHd3a蛋白第14位的精氨酸突變?yōu)辄S毛谷SiHd3a蛋白的甘氨酸，第3處突變?yōu)橥x突變，未造成所編碼氨基酸的改變(圖7)。

粗體下劃線.起始密碼子和終止密碼子；下劃線.引物序列。

圖6 黃毛谷與豫谷1號(hào)SiHd3a基因序列比對(duì)結(jié)果

圖7 黃毛谷與豫谷1號(hào)SiHd3a蛋白序列比對(duì)結(jié)果

2.4 谷子SiHd3a蛋白的理化性質(zhì)分析

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SiHd3a蛋白分子質(zhì)量為19.74 ku，等電點(diǎn)(pI)為6.82。其一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸豐度依次為甘氨酸(Gly，19個(gè)，10.70%)、纈氨酸(Val，18個(gè)，10.10%)、脯氨酸(Pro，16個(gè)，9.00%)、精氨酸(Arg，16個(gè)，9.00%)、亮氨酸(Leu，12個(gè)，6.70%)、丙氨酸(Ala，11個(gè)，6.02%)、天冬氨酸(Asp，11個(gè)，6.02%)、蘇氨酸(Thr，11個(gè)，6.02%)、苯丙氨酸(Phe，10個(gè)，5.60%)、天冬酰胺(Asn，8個(gè)，4.50%)、谷氨酰胺(Gln，7個(gè)，3.90%)、蛋氨酸(Met，7個(gè)，3.90%)、絲氨酸(Ser，7個(gè)，3.90%)、絡(luò)氨酸(Tyr，7個(gè)，3.90%)、谷氨酸(Glu，6個(gè)，3.40%)、半胱氨酸(Cys，3個(gè)，1.70%)、組氨酸(His，3個(gè)，1.70%)、異亮氨酸(Ile，3個(gè)，1.70%)、色氨酸(Trp，2個(gè)，1.10%)、賴氨酸(Lys，1個(gè)，0.60%)。帶負(fù)電荷的氨基酸有Asp、Glu，共17個(gè)，帶正電荷的氨基酸有Arg、Lys，共17個(gè)。對(duì)SiHd3a蛋白的親/疏水性進(jìn)行分析表明，多肽鏈的第143位氨基酸分值最低，為-2.422，第13位氨基酸分值最高，為1.978。從整體上看，SiHd3a的親水氨基酸多于疏水氨基酸，可初步判斷SiHd3a為親水蛋白。

2.5 谷子SiHd3a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與亞細(xì)胞定位

SiHd3a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見表1，可以看出，谷子SiHd3a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋29個(gè)，所占比例為16.29%；延伸鏈52個(gè)，所占比例為29.21%；β轉(zhuǎn)角20個(gè)，所占比例為11.24%；無規(guī)則卷曲77個(gè)，所占比例為43.26%。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，谷子SiHd3a蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)。

表1 SiHd3a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成

2.6 谷子SiHd3a蛋白進(jìn)化樹分析

從 NCBI 獲取與谷子SiHd3a蛋白相似性高的8種植物Hd3a蛋白氨基酸序列，構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果見圖8，可以看出，谷子與野生黍(Panicumhallii)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)親緣關(guān)系最近，4個(gè)物種聚為一個(gè)組，其次與節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)親緣關(guān)系較近，與3種稻類親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖8 基于Hd3a蛋白氨基酸序列的9個(gè)物種進(jìn)化樹

2.7 谷子SiHd3a基因表達(dá)半定量分析

SiHd3a基因在長(zhǎng)、短日照條件下晝夜表達(dá)情況見圖9。從圖9可以看出，在短日照條件下SiHd3a基因呈24 h晝夜節(jié)律性表達(dá)特點(diǎn)：從下午15：00黑暗開始至凌晨3：00整個(gè)暗夜期，除凌晨3：00有少量表達(dá)外其余時(shí)間基因表達(dá)量均較低，早晨6：00開始光照，基因表達(dá)量最高，達(dá)到第1個(gè)峰值，早晨9：00至中午12：00 光照期間SiHd3a基因表達(dá)量有所下降，但仍維持較高表達(dá)水平，12：00達(dá)到1個(gè)小高峰。在長(zhǎng)日照條件下SiHd3a基因表達(dá)并沒有出現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性，從早晨6：00光照開始至凌晨3：00，無論光照期還是黑暗期SiHd3a基因均具有較強(qiáng)的表達(dá)活性，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量差異不明顯，這與水稻中Hd3a基因長(zhǎng)日照下表達(dá)規(guī)律不同。

A.短日照條件下；B.長(zhǎng)日照條件下。

3 結(jié)論與討論

利用RT-PCR技術(shù)從黃毛谷克隆得到SiHd3a基因cDNA序列，包含1個(gè)537 bp的開放讀碼框，編碼178個(gè)氨基酸；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SiHd3a為親水蛋白，定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)，谷子與野生黍、玉米、高粱的Hd3a蛋白進(jìn)化關(guān)系較近，而與稻類進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)；SiHd3a基因在短日照條件下呈晝夜節(jié)律性表達(dá)，早晨6：00見光時(shí)達(dá)到最高峰，長(zhǎng)日照條件下SiHd3a基因在晝夜24 h內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)。

Hd3a屬于水稻FT-like基因家族，該家族包括13個(gè)成員[12-13]，其中Hd3a/FT-L2與RFT1(RICEFLOWERINGLOCUST1)/FT-L3同源性最高。在不同植物間Hd3a基因具有很高的保守性[14-15]。本研究表明，Hd3a蛋白在谷子、野生黍、玉米、高粱之間的進(jìn)化關(guān)系比較近，而與水稻進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，說明Hd3a進(jìn)化過程中在C3與C4作物間可能產(chǎn)生了功能上的分化。

在野生型水稻中引入Hd3a可以導(dǎo)致早花表型，而利用RNAi(RNA interference)抑制Hd3a的表達(dá)會(huì)推遲開花，說明Hd3a具有促進(jìn)水稻開花的功能[16-17]。將在大腸桿菌中表達(dá)的Hd3a重組蛋白分離純化后，對(duì)大花蕙蘭和蝴蝶蘭的葉和葉基部莖進(jìn)行不同濃度蛋白注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射的植株和未注射的植株在開花進(jìn)程中未產(chǎn)生顯著差異[18]。事實(shí)上，Hd3a蛋白在葉片維管組織中合成，然后通過韌皮部維管組織運(yùn)輸?shù)巾敹朔稚M織，證明Hd3a 蛋白可以長(zhǎng)距離運(yùn)輸[19]。Hd3a基因是水稻開花調(diào)控途徑的信息整合基因，負(fù)責(zé)將來自各種途徑的開花信號(hào)匯總起來，繼而誘導(dǎo)下游的花器官?zèng)Q定基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)開花[20]。作為短日照植物，水稻的成花包括短日照促進(jìn)途徑和長(zhǎng)日照抑制途徑。短日照條件下水稻主要通過2條途徑即Hd1(Heading date 1)途徑和Ehd1(Early heading date 1)途徑促進(jìn)開花，Hd1和Ehd1基因在短日照條件下表達(dá)能夠促進(jìn)Hd3a的表達(dá)，從而加速水稻開花[21-22]。Hd1對(duì)Hd3a的調(diào)控并不像擬南芥CO(CONSTANS)調(diào)控FT那樣簡(jiǎn)單，Hd1在長(zhǎng)日照、短日照條件下均能正常表達(dá)，但是長(zhǎng)日照條件下對(duì)開花起抑制作用，與短日照相反。Ehd1僅在短日照條件下誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)具有節(jié)律性，在Hd1基因失活的條件下仍能通過促進(jìn)Hd3a的表達(dá)來誘導(dǎo)開花，且表達(dá)模式與Hd3a一致[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，SiHd3a基因在短日照條件下表現(xiàn)晝夜節(jié)律表達(dá)特性，早晨6：00開始光照表達(dá)量最高，這與水稻Hd3a基因短日照條件下在黎明表達(dá)量最高是一致的[24]，這種節(jié)律性表達(dá)可能是受Ehd1調(diào)控的結(jié)果。長(zhǎng)日照條件下，水稻Hd3a基因表達(dá)量在各個(gè)階段都較低，因?yàn)镠d1在長(zhǎng)日照條件下抑制Hd3a的表達(dá)，同時(shí)Ehd1基因表達(dá)量較低[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)日照條件下SiHd3a基因晝夜24 h內(nèi)均有較強(qiáng)的表達(dá)活性，與水稻Hd3a長(zhǎng)日照條件下低表達(dá)相反，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是本研究獲得的SiHd3a基因在長(zhǎng)日照條件下對(duì)谷子開花沒有作用，谷子中可能存在著另一個(gè)成花素基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)抽穗開花。因?yàn)楸狙芯克褂玫墓茸硬牧宵S毛谷對(duì)光周期敏感，長(zhǎng)日照條件下抽穗期嚴(yán)重推遲，這與SiHd3a基因長(zhǎng)日照條件下的高表達(dá)量存在矛盾。