王 穩(wěn)，靳麗宇，張利輝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001)

目前，新型除草劑的研發(fā)主要依賴于天然除草活性物質(zhì)[1-2]。在天然源除草劑的研發(fā)過程中，以天然除草活性物質(zhì)為探針發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)已經(jīng)成為新型除草劑創(chuàng)制的主要途徑[3]。但是，至今已經(jīng)明確的除草作用靶標(biāo)僅有20多種，且距離最后一種除草作用靶標(biāo)HPPD被報(bào)道已有30多年[4-5]。因此，探究一種新型除草活性物質(zhì)的除草作用方式具有重要意義[6-7]。

4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯是天然除草活性物質(zhì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸的酯類衍生物之一，因其具有良好的脂溶性與除草活性且易于合成等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為待開發(fā)的新型除草活性物質(zhì)之一[8-9]。4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)常見雜草馬唐的抑制中濃度(IC50)為129.95 mg/L，對(duì)馬齒莧芽的IC50為227.05 mg/L，對(duì)反枝莧芽的IC50為227.05 mg/L。當(dāng)用1 000 mg/L的4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯莖葉噴施擬南芥24 h后，其葉片表面出現(xiàn)失綠黃化現(xiàn)象[10-13]。

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素實(shí)驗(yàn)室張明月等[10]前期對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯處理后的擬南芥進(jìn)行了蛋白水平的分析，結(jié)果顯示1 000 mg/L的4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯莖葉噴施后的擬南芥中，共有30個(gè)差異倍數(shù)大于20的蛋白，其中只有差異蛋白gi|15224205|ref|NP_181831.1|和gi|334183674|ref|NP_001185328.1|表達(dá)量上調(diào)，因此，這2個(gè)蛋白在4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的除草過程中起著重要作用。本試驗(yàn)獲得了蛋白gi|15224205|ref|NP_181831.1|和gi|334183674|ref|NP_001185328.1|的相關(guān)基因AT2G43030和AT1G66240的T-DNA插入突變體，通過比較突變體株系與野生型株系對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的敏感程度，確定擬南芥AT2G43030、AT1G66240基因在4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯除草過程中的作用，為探索新的除草劑作用方式奠定了基礎(chǔ)[14]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞野生型擬南芥(Columbia，Col-0生態(tài)型)；擬南芥AT2G43030基因的T-DNA插入株系(Columbia，Col-0生態(tài)型)：SALK_026275、SALK_036415、SALK_027717；擬南芥AT1G66240基因的T-DNA插入株系(Columbia，Col-0生態(tài)型)：SALK_026221、CS857899、CS856641均由擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫-tair網(wǎng)站購得。

1.2 擬南芥T-DNA插入純合株系篩選

選取2～3片未抽薹擬南芥植株的蓮座葉片，無菌超純水清洗后放到1.5 mL離心管中，液氮速凍，電鉆勻漿，使用 Plant Genomic DNA Kit(TIAN GEN，中國) 試劑盒提取DNA，并用二引物法驗(yàn)證純合株系。

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，2×PCR Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，LB與RP引物各1 μL /LP與RP引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，42個(gè)循環(huán)最后72 ℃延伸10 min。

二引物法是利用基因T-DNA插入片段的正向引物(LB)和插入位點(diǎn)兩側(cè)的基因序列的特異性正向引物和反向引物(LP和RP)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該方法需要2組PCR擴(kuò)增，一組以LP和RP為引物，另一組以LB和RP為引物。在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果圖中，野生型擬南芥只有LP和RP擴(kuò)增出1條目的條帶；T-DNA插入雜合株系中，LP和RP、BP和RP共擴(kuò)增出2條目的條帶；T-DNA插入純和株系只有BP和RP擴(kuò)增出1條目的條帶。本次試驗(yàn)所用突變體株系的T-DNA插入位點(diǎn)及其鑒定所用引物序列見表1。

表1 擬南芥AT2G43030和AT1G66240 基因T-DNA插入株系的插入位點(diǎn)及其引物序列

1.3 莖葉噴霧法測(cè)定不同株系擬南芥對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的敏感性

藥劑配制以丙酮∶(含0.1%吐溫80)水=3∶97(V/V)為溶劑，加入化合物4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯至終質(zhì)量濃度為1 000 mg/L(與iTRAQ試驗(yàn)濃度相對(duì)應(yīng))，使用POTTER噴霧塔噴霧處理7種供試擬南芥，使用前用甲醇和水沖洗體系，每盆噴霧量2 mL，之后放回原溫室中，24 h后進(jìn)行性狀比對(duì)。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)AT2G43030和AT1G66240基因的表達(dá)量

按1.3所述莖葉噴霧處理不同株系的擬南芥植株后，分別在15，30，45 min 3個(gè)時(shí)間段取樣，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，設(shè)置空白對(duì)照。取樣后立即放入液氮中，備用。

將備用樣品電鉆勻漿，使用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒與HiScript Ⅱ Q Select RT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄，獲得樣品的cDNA(具體操作見說明書)。無酶水稀釋cDNA濃度至300 ng/μL，使用Trans Start Green qPCR Super Mix試劑盒測(cè)定基因的表達(dá)水平，本次試驗(yàn)選用持家基因UBQ作為內(nèi)參基因。

表2 擬南芥AT2G43030和AT1G66240 基因的RT-qPCR引物序列

RT-qPCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，2×Trans Star?Tip Green qPCR Super Mix 7 μL，ddH2O 1 μL，正向引物(F)和反向引物(R)各0.5 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，42個(gè)循環(huán)。根據(jù)NCBI中獲得的差異基因CDS序列設(shè)計(jì)RT-qPCR所需引物，引物序列見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥AT2G43030和AT1G66240基因的T-DNA插入純合株系的驗(yàn)證結(jié)果

使用二引物法驗(yàn)證6種T-DNA插入株系的T3植株是否為純合株系，其驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖中，凝膠孔1，3，5，7，9，11表示插入位點(diǎn)兩側(cè)的基因序列的特異性引物L(fēng)P和RP沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；凝膠孔2，4，6，8，10，12表示插入片段的正向引物L(fēng)B和插入位點(diǎn)右側(cè)序列的反向引物RP有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物且大小在400～800 bp，符合插入片段的大小范圍。上述結(jié)果說明了6種T-DNA插入株系的T3均為純合株系。

1，2.SALK_026275的純合株系驗(yàn)證結(jié)果；3，4.SALK_036415的純合株系驗(yàn)證結(jié)果；5，6.SALK_027717的純合株系驗(yàn)證結(jié)果；7，8.SALK_026221的純合株系驗(yàn)證結(jié)果；9，10.CS857899的純合株系驗(yàn)證結(jié)果；11，12.CS856641的純合株系驗(yàn)證結(jié)果。凝膠孔下方條帶均為引物二聚體。

1, 2. Verification results of homozygous lines of SALK_026275; 3, 4. Verification results of homozygous lines of SALK_036415; 5, 6.Verification results of homozygous lines of SALK_027717; 7, 8.Verification results of homozygous lines of SALK_026221; 9, 10.Verification results of homozygous strains of CS857899; 11, 12.Verification results of homozygous lines of CS856641. The bands below the gel holes were all primers dimers.

圖1 6種擬南芥T-DNA插入純合株系的驗(yàn)證

Fig.1 Validation of sixA.thalianaT-DNAinsertion homozygous lines

2.2 T-DNA插入純合株系內(nèi)基因AT2G43030和AT1G66240表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

利用q-PCR測(cè)定擬南芥AT2G43030和AT1G66240基因的T-DNA插入純合株系中相應(yīng)基因的表達(dá)水平。如圖2所示：在AT2G43030的表達(dá)水平測(cè)定中當(dāng)野生型擬南芥(WT)表達(dá)量為1.00± 0.06時(shí)，SALK_026275株系的相對(duì)表達(dá)量為0.66±0.08，SALK_036415株系的表達(dá)量為0.34±0.07，SALK_027717株系的相對(duì)表達(dá)量為0.34±0.02；在AT1G66240的表達(dá)水平測(cè)定中當(dāng)野生型擬南芥(WT)相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.07時(shí)，SALK_026221株系的相對(duì)表達(dá)量為0.30±0.03，CS857899株系的相對(duì)表達(dá)量為0.57±0.10，CS856641株系的相對(duì)表達(dá)量為0.66±0.08。結(jié)果表明：與野生型擬南芥相比，6種T-DNA插入純合株系相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)量均降低，說明基因上的T-DNA插入會(huì)引起基因的失活且6種T-DNA插入純合株系均可用于下一步試驗(yàn)中對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯敏感性的測(cè)定。

圖中小寫字母a、b表示P=0.05水平差異顯著。

Ⅰ.擬南芥的整株受損情況；Ⅱ.擬南芥的第1對(duì)真葉受損情況；Ⅲ.擬南芥的蓮座葉受損情況；Ⅳ.擬南芥的莖生葉受損情況。

2.3 不同株系擬南芥對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的敏感性

1 000 mg/L的4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯莖葉噴霧處理擬南芥24 h后，其均出現(xiàn)黃化、皺縮、萎蔫失水等癥狀，但不同株系的受損程度不同。選取相同生長(zhǎng)時(shí)間、不同株系的同一部位的葉片，在顯微鏡下觀察其癥狀。

如圖3所示，整株擬南芥(圖3-Ⅰ)中，野生型擬南芥(WT)癥狀最輕僅出現(xiàn)葉片黃化、頂端干枯現(xiàn)象；SALK_026275、SALK_036415、SALK_027717株系擬南芥(A1、A2、A3)和SALK_026221、CS857899、CS856641株系擬南芥(B1、B2、B3)均出現(xiàn)頂端干枯、葉片皺縮失水且出現(xiàn)水漬狀潰爛等現(xiàn)象，其中A1癥狀較輕，B3癥狀最嚴(yán)重，其原因可能與其插入位點(diǎn)有關(guān)。

擬南芥第1對(duì)真葉(圖3-Ⅱ)中，WT僅出現(xiàn)皺縮卷曲現(xiàn)象；A1、A2葉尖部分全部干枯，葉片表面失水皺縮，A3的表皮毛明顯增多且出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象；B1、B2、B3葉表面嚴(yán)重皺縮失水、且出現(xiàn)黃花萎蔫現(xiàn)象。

在擬南芥的蓮座葉(圖3-Ⅲ)中，WT受損現(xiàn)象較輕，出現(xiàn)輕微黃化現(xiàn)象；A1、A2葉片卷曲，A3葉片出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮失水現(xiàn)象；B1、B2、B3葉片失水皺縮，葉面積變小，但并未出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。

在擬南芥的莖生葉(圖3-Ⅳ)中， WT葉柄部位黃化干枯，但葉片仍有一定生命力；A1、A2、A3均黃化、皺縮變形，且表皮毛大量增多；B1、B2、B3卷曲黃化、失水皺縮，表皮毛大量增多。綜合以上現(xiàn)象可知，相比野生型擬南芥(WT)，AT2G43030與AT1G66240的T-DNA插入株系(A、B)對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯更為敏感。

2.4 4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯處理不同株系的擬南芥后AT2G43030和AT1G66240基因的表達(dá)量變化

利用q-PCR測(cè)定不同株系的擬南芥體內(nèi)基因AT2G43030和基因AT1G66240的相對(duì)表達(dá)量，如圖4所示。使用1 000mg/L的4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯莖葉噴霧處理不同株系的擬南芥，15，30，45 min后分別取樣測(cè)定基因AT2G43030和基因AT1G66240的相對(duì)表達(dá)量。野生型擬南芥體內(nèi)基因AT2G43030和基因AT1G66240的表達(dá)量均表現(xiàn)不同幅度的上調(diào)，而6種T-DNA插入純合株系相關(guān)基因的表達(dá)量均未發(fā)生變化。綜合2.3中不同株系的擬南芥葉片受損癥狀，可以確定擬南芥T-DNA插入株系對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯更為敏感是由于基因AT2G43030和基因AT1G66240的表達(dá)量降低引起的，所以擬南芥基因AT2G43030和基因AT1G66240參與擬南芥對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的抗逆反應(yīng)。

圖4 莖葉噴霧后不同株系的擬南芥在不同時(shí)間點(diǎn)基因AT2G43030和基因AT1G66240的表達(dá)水平比較

3 討論與結(jié)論

本研究中，莖葉噴施4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯前后基因AT2G43030和AT1G66240在T-DNA插入株系中的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化，在野生型株系中這2個(gè)基因的表達(dá)量均上調(diào)；觀察莖葉噴施4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯24 h后不同株系的葉片損傷程度，與野生型株系相比T-DNA插入株系受損更為嚴(yán)重。因此，可以確定AT2G43030和AT1G662402個(gè)基因能夠抵御4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)植株造成的傷害。同時(shí)，基因AT2G43030和AT1G66240的上調(diào)可能是為了彌補(bǔ)擬南芥某些受損基因的功能缺失?；駻T2G43030編碼50S亞單位質(zhì)體核糖體蛋白，主要存在于葉綠體包膜、葉綠體基質(zhì)中，與細(xì)胞的增殖有關(guān)[15]；AT1G66240編碼抗氧化劑同系物1蛋白，該蛋白主要存在于擬南芥的細(xì)胞膜上，參與擬南芥的銅離子運(yùn)輸過程[16]，說明4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的除草作用機(jī)制與植株的光合作用和細(xì)胞膜功能有關(guān)。

除草活性物質(zhì)的作用方式及作用位點(diǎn)研究一直是開發(fā)新型除草劑的難點(diǎn)，而近些年來隨著蛋白組學(xué)、基因組學(xué)等技術(shù)的進(jìn)步，以生物信息為指導(dǎo)、從宏觀到微觀的天然產(chǎn)物的作用靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)模式逐漸被人們所關(guān)注，該模式極大地推進(jìn)了新型除草劑的研究[17-18]。唐奕教授課題組等運(yùn)用以抗性基因?yàn)閷?dǎo)向的基因組挖掘技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)了一種新型天然產(chǎn)物除草劑aspterric acid(AA)，同時(shí)，成功構(gòu)建了具有AA耐受性的轉(zhuǎn)基因作物，為該類型除草劑的開發(fā)提供了可能性[19]；Wallace 等[20]以DNA回旋酶為藥物靶標(biāo)，靶向篩選了殺菌劑氟喹諾酮環(huán)丙沙星1，后又將其應(yīng)用于除草劑，靶向合成了更具選擇性的除草活性衍生物；Wright等[21]利用RNA-sep技術(shù)測(cè)定了除草劑甲氧咪草煙對(duì)棘球藻基因表達(dá)水平的影響，為咪唑啉酮類除草劑的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。本研究以前期蛋白組學(xué)的結(jié)果為依據(jù)，從基因水平解釋4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的除草作用機(jī)制，該研究方式為精確闡釋天然活性產(chǎn)物的作用方式提供了新的策略，結(jié)合本研究中的天然活性產(chǎn)物及其作用方式研究，可為后續(xù)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸類天然產(chǎn)物除草劑的發(fā)掘提供新的思路與啟示。