陳利達，石延霞，謝學文，曹金強，柴阿麗，李寶聚

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜花卉研究所，北京 100081；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

番茄(Solanumlycopersicum)作為世界范圍內(nèi)栽培最為普遍的蔬菜之一，不僅產(chǎn)量高、適應性廣，且營養(yǎng)價值高。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計，2012年全球番茄總產(chǎn)量高達1.62億t，產(chǎn)值超過550億美元[1]。2015年經(jīng)農(nóng)業(yè)部市場與經(jīng)濟信息司發(fā)布的信息顯示：我國番茄年產(chǎn)量達5 594萬t，占全國蔬菜總產(chǎn)量的7.1%[2]。隨著我國番茄種植面積日益擴大，番茄病毒病也逐漸加重，成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，給農(nóng)戶造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，明確我國不同地區(qū)番茄主要病毒種類，對于番茄病毒病的防控具有重要意義。

番茄病毒病在全球普遍存在，自1909年于美國番茄植株上發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)后，世界各地先后報道了主要病毒種類。目前，國際上已報道危害番茄病毒的種類有40余種[3]，我國現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)侵染番茄的病毒種類25種，包括黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、馬鈴薯S病毒(PotatovirusS，PVS)[4]、番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)[5]、番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)[6]、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus，ToMV)[7]、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、馬鈴薯 X 病毒(PotatovirusX，PVX)、馬鈴薯 Y 病毒(PotatovirusY，PVY)、蠶豆萎蔫病毒(Broadbeanwiltvirus，BBWV)等RNA病毒和中國番木瓜曲葉病毒(PapayaleafcurlChinavirus，PaLCuCNV)[8]和番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)等DNA病毒。通常番茄病毒病受當?shù)氐沫h(huán)境、品種、栽培管理因素較大，因此，導致不同地區(qū)的番茄病毒病種類不同。王勇等[9]對天津5個區(qū)縣的255份番茄樣品進行鑒定，結(jié)果表明，CMV和TYLCV是天津地區(qū)病毒病的主要毒源之一；劉永光等[10]在山東省壽光地區(qū)進行番茄病毒病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ToCV的發(fā)病率高達20%～100%，造成減產(chǎn)10%～40%，成為該地區(qū)主要毒源。

我國是蔬菜生產(chǎn)與出口第一大國，設施和露地番茄栽培面積逐漸加大，若田間管理不當可增大病毒侵染機率，導致病毒病暴發(fā)，對其產(chǎn)量與品質(zhì)具有重大影響。針對番茄病毒病危害不斷加重，目前番茄病毒復合侵染情況的相關報道較少，缺少對我國不同地區(qū)番茄主要病毒種類進行系統(tǒng)研究的報道。因此，明確我國不同地區(qū)番茄病毒病種類主次關系，以及是否存在病毒復合侵染現(xiàn)象，為田間針對性地預警和防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

試驗于2015-2018年在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所菜病綜防組完成。

1.1 試驗材料

2015-2018年，在我國的北京、山東、四川、河南、天津、江蘇、甘肅、遼寧、寧夏、西藏、貴州、河北、新疆、黑龍江、浙江、廣西、山西、陜西、海南、內(nèi)蒙古等地共采集花葉、斑駁、壞死、畸形等疑似病毒病感染的番茄樣本431份，于-80 ℃冰箱中備用。

植物RNA提取試劑TRIzol(上海英濰捷基貿(mào)易有限公司)、TaqDNA 聚合酶；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit(北京天根生物科技有限公司)；2×TaqMix(北京博邁德科技有限公司)。

1.2 供試引物信息

試驗所使用番茄病毒引物共12種，引物信息見表1。其中特異性引物TYLCV-1/TYLCV-2和TSWV-1/TSWV-2根據(jù)外殼蛋白(Coat protein，CP)基因自行設計，其他引物引自文獻。引物特異性檢測供試菌株信息見表2。

1.3 植物總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法[19]將超低溫凍結(jié)的番茄葉片迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預冷的研缽中研磨成粉末狀，裝入預冷的離心管(1.5 mL)。加入1 mL TRIzol試劑，充分振蕩均勻，室溫靜止5 min；12 000 r/min離心10 min(恒溫4 ℃)；將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管(1.5 mL)，加入總體積的1/5氯仿，混勻后室溫靜止5 min；12 000 r/min離心10 min(恒溫4 ℃)；取水相(約400 μL)加入等體積的異丙醇，溫室內(nèi)靜止10 min；12 000 r/min離心10 min(恒溫4 ℃)；去上清液后加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀2次，12 000 r/min離心5 min(恒溫4 ℃)；室溫自然晾干，使用RNase-Free ddH2O(50 μL)溶解，于-80 ℃冰箱保存。番茄樣品總DNA提取參照TIANGEN公司植物基因組DNA提取系統(tǒng)說明進行，陰性對照為健康的番茄葉片。

表1 番茄病毒病分子檢測的引物信息

表2 供試病毒信息

注：以上病毒由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉所提供。

Note: The above viruses are provided by the the Institute of Vegetable and Flowers, Chinese Academy Agricultural Sciences.

以番茄感病葉片總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應體系(10 μL)：RNA模板2 μL，5×gDNA Buffer 2 μL，Rnase-Free H2O 6 μL，42 ℃變性3 min，立即放置冰上2 min，再加入以下試劑：10×Fast RT-Buffer 2 μL，Primer Mix 2 μL，RT-Enzyme Mix 1 μL，RNase-Free H2O 5 μL，總體積為20 μL。42 ℃保溫15 min，再 95 ℃保溫3 min，放置冰上進行保存。

1.4 番茄病樣RT-PCR檢測

以病樣提取總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit合成病毒cDNA第1條鏈。使用文獻已報道特異性引物CMV-F/CMV-R、ToMV-1/ToMV-2、PVX-1/PVX-2、PVY-F/PVY-R、TMV-1/TMV-2、ToCV-F/ToCV-R、R2F-F/R2F-R、TICV-CF/TICV-CR、T-1/T-2、Fxyw-F/Fxyw-R對不同樣本模板進行RT-PCR擴增，該引物序列由北京博邁德科技有限公司合成，詳細信息見表1。

PCR擴增體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃補充延伸10 min。擴增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照并進行結(jié)果分析。此外，將配制的PCR產(chǎn)物(50 μL)送至博邁德科技(北京)有限公司進行基因測序；并利用NCBI在線分析服務器軟件Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序進行核酸序列同源性比對，以此確定檢測病毒種類。

1.5 病毒的測序及序列分析

從采集的番茄病毒樣本中選用TYLCV和TSWV進行陽性克隆，送至博邁德科技(北京)有限公司測序，通過NCBI網(wǎng)站在線將測序結(jié)果與基因庫已有的序列進行Blast比對，利用MEGA 5.0軟件將反饋的序列與GenBank中已上傳的代表性系列進行同源性比對，并使用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

利用所設計的引物TYLCV-1/TYLCV-2和TSWV-1/TSWV-2對12種不同的番茄病毒病進行普通PCR擴增，結(jié)果顯示：只有番茄黃化曲葉病毒和番茄斑萎病毒特異性引物分別在648，425 bp處擴增出特異目的條帶，其他菌株和陰性對照均無擴增產(chǎn)物(圖1-A、B)。

A： M.分子質(zhì)量標準BM5000 DNA Marker; 1.番茄黃化曲葉病毒; 2-3.番茄花葉病毒; 4-5.黃瓜花葉病毒; 6-7.馬鈴薯Y病毒; 8-9. 番茄褪綠病毒; 10.番茄斑萎病毒; 11-12.煙草花葉病毒;N. 陰性對照。B： M.分子質(zhì)量標準BM5000 DNA Marker; 1. 番茄斑萎病毒; 2-3.番茄花葉病毒; 4-5.黃瓜花葉病毒; 6-7.馬鈴薯Y病毒; 8-9. 番茄褪綠病毒; 10. 番茄黃化曲葉病毒; 11-12.煙草花葉病毒;N. 陰性對照。

A: M. Molecular weight BM5000 DNA Marker; 1.Tomatoyellowleafcurlvirus; 2-3.Tomatomosaicvirus; 4-5.Cucumbermosaicvirus; 6-7.PotatovirusY; 8-9.Tomatochlorosisvirus; 10.Tomatospottedwiltvirus; 11-12.Tobaccomosaicvirus;N.ddH2O. B: M. Molecular weight BM5000 DNA Marker; 1.Tomatospottedwiltvirus; 2-3.Tomatomosaicvirus; 4-5.Cucumbermosaicvirus; 6-7.PotatovirusY; 8-9.Tomatochlorosisvirus; 10.Tomatoyellowleafcurlvirus; 11-12.Tobaccomosaicvirus;N.ddH2O.

圖1 TYLCV與TSWV引物特異性檢測結(jié)果

Fig.1 The specificity of the selected primes to TYLCV or TSWV

對431份番茄病毒樣本進行總RNA/DNA提取，并利用試驗中特異性引物對其進行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示(圖2)：待測番茄病毒樣品中特異性引物TYLCV-1/TYLCV-2、TSWV-1/TSWV-2、ToCV-F/ToCV-R、ToMV-1/ToMV-2、CMV-F/CMV-R、TMV-1/TMV-2和PVY-F/PVY-R分別可擴增出大小648，425，450，480，260，470，420 bp的相應條帶；而陰性對照未擴增；表明在待檢樣品中能分別測出TYLCV、TSWV、ToCV、ToMV、CMV、TMV和PVY，但未檢測出其他病毒種類。

2.2 侵染我國不同地區(qū)番茄的主要病毒種類及檢測結(jié)果

通過對431份番茄樣品提取總RNA/DNA，利用不同特異性引物對其進行RT-PCR擴增，結(jié)果表明(表 3)：檢出的病毒種類共7種，分別為TYLCV、TSWV、ToCV、ToMV、CMV、TMV和PVY。其中，425份病樣均檢出病毒，有 6個樣品未檢測到病毒，病毒檢出率高達 98.61%。

根據(jù)我國20個(省/自治區(qū))地區(qū)的番茄病毒發(fā)生及危害程度(表3、圖3-4)，表明北京地區(qū)番茄病毒病發(fā)生最為嚴重，共檢出7種病毒，與其他地區(qū)相比有顯著差異(P<0. 05)；其次是山東地區(qū)檢測出5種病毒，未檢出TSWV和PVY病毒，且TYLCV為北京和山東地區(qū)優(yōu)勢病毒種類；河南、甘肅和寧夏等地區(qū)檢測到4種病毒，西藏、河北、浙江、陜西和海南地區(qū)檢測到3種病毒，四川、天津、黑龍江、山西、內(nèi)蒙古等檢測到2種病毒，其他地區(qū)只檢測到單一番茄病毒種類。

M.分子質(zhì)量標準BM5000 DNA Marker; 1.番茄黃化曲葉病毒; 2. 番茄斑萎病毒; 3. 番茄褪綠病毒; 4. 番茄花葉病毒; 5. 黃瓜花葉病毒; 6. 煙草花葉病毒; 7. 馬鈴薯Y病毒;N. 陰性對照。

M. Molecular weight BM5000 DNA Marker; 1.Tomatoyellowleafcurlvirus; 2.Tomatospottedwiltvirus; 3.Tomatochlorosisvirus; 4.Tomatomosaicvirus; 5.Cucumbermosaicvirus; 6.Tobaccomosaicvirus; 7.PotatovirusY;N.ddH2O.

圖2 我國番茄上檢出的病毒電泳結(jié)果

Fig.2 Electrophoresis results of virus detectedon tomatoes in China

表3 我國番茄病毒病種類及分布

對番茄病毒種類整理并進行數(shù)據(jù)分析(圖3)，TYLCV的檢出率最高，可達65.20%，與其他病毒種類相比有顯著差異(P<0. 05)，是危害我國番茄的主要病毒；其次為ToCV和TMV，檢出率分別為 21.11%，20.19%；TSWV、ToMV、CMV和PVY總檢出率略低，各種類間無差異顯著性，分別為14.15%，15.31%，17.63%，11.37%。

不同小寫字母表示在 0.05 水平上差異顯著(P<0.05)。圖4同。

圖4 我國不同地區(qū)番茄病毒病檢出量

2.3 我國不同地區(qū)番茄病毒的復合侵染分析

在 431份陽性樣品中(表4)，發(fā)現(xiàn) 271 份番茄病樣為單一病毒侵染，2種及2種以上病毒復合侵染樣品為154份，占總量的 35.73%，其中 2種病毒復合侵染所占比例最高，檢出率占復合侵染總比的 52.60%，且2種病毒復合侵染類型主要是TYLCV+TMV、TYLCV+CMV、TYLCV+ToCV、CMV+PVY、TYLCV+PVY和TYLCV+ToMV，而TYLCV+ToCV為復合侵染優(yōu)勢種；3種病毒復合侵染率為 27.92%，侵染類型為TYLCV+ToCV+CMV、TYLCV+TMV+PVY、TYLCV+PVY+CMV、TYLCV+CMV+TMV及CMV+ ToMV+TMV；4種及5種病毒復合侵染類型較為復雜，主要是CMV+ ToMV+TMV+TYLCV和TYLCV+ToCV+TMV+CMV+PVY，未檢測出6種及6種以上病毒復合侵染現(xiàn)象。

表4 我國番茄主要病毒病復合侵染率

2.4 TYLCV和TSWV系統(tǒng)進化樹分析

將分離得到的TYLCV-BJ 與已報道的10個TYLCV分離物基因組進行同源性比較，結(jié)果表明：所得到的分離物與其他序列相似性為95%～99%。如圖5顯示，其中TYLCV-BJ分離物(MK336782)與中國湖南在番茄上得到分離物(KY783940.1)、中國山西在番茄得到的分離物(KY491005.1)聚在同一進化分支中，其中與中國湖南在番茄上得到分離物(KY783940.1)相似度最高且親緣關系最近，高達99%。

圖5 基于TYLCV基因組部分核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

此外，用系統(tǒng)進化樹分析番茄的TSWV-HN分離物(MK318839)與其他14種TSWV分離物之間的親緣關系(圖6)。14種分離物序列共分為兩大分支，其中塞爾維亞的煙草分離物(GQ373173.1)，反枝莧分離物(JX262136.1)和番茄分離物(KF184652.1)，波黑地區(qū)的甜椒分離物(KX710199.1、KY437080.1)，委內(nèi)瑞拉的非洲菊分離物(KF146702.1)，菊花屬分離物(KF146701.1)，土耳其地區(qū)的辣椒分離物(KY973679.1)，山東地區(qū)的南瓜分離物(KX185153.1)與河南番茄分離物(MK318839)在一大類，表明這幾種分離物與番茄的TSWV-HN親緣關系較其他分離物更近，其中番茄的TSWV-HN分離物與山東分離物(KX185153.1)的親緣關系最近，與核苷酸序列對比結(jié)果一致，因此，明確該分離物為TSWV種類。

圖6 基于TSWV基因組部分核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)如今，番茄已成為我國重要的蔬菜主導產(chǎn)業(yè)之一。隨著我國番茄栽培面積不斷加大，病毒病的危害愈發(fā)嚴重，從而影響了番茄品種與產(chǎn)量，給生產(chǎn)者帶來重大的經(jīng)濟損失。不同地區(qū)的番茄病毒種類不盡相同，如河南[20]、江蘇部分地區(qū)[21]、南京部分地區(qū)[22]等地均對番茄上的病毒種類進行過系統(tǒng)的研究。前人對不同地區(qū)的番茄病毒病種類有所鑒定與分析，但缺乏對我國不同(省/自治區(qū))番茄上的病毒進行全面系統(tǒng)的調(diào)查研究。

本研究自2015-2018年從我國20個省(自治區(qū))采集431疑似病毒感染番茄植株，利用CMV、ToMV、PVY、PVX、TMV、BBWV、TYLCV、ToCV、TSWV、TICV、TYLCVNB和PaLCuCNV共12種番茄常見病毒特異性引物，對其番茄樣品進行病毒RT-PCR分子檢測，結(jié)果顯示，98.61%的樣品都被病毒所感染，初步確定侵染番茄的病毒種類有7種(TYLCV、ToCV、TMV、CMV、ToMV、TSWV、PVY)，不同地區(qū)的病毒優(yōu)勢種不同，在本次檢測樣品中TYLCV為我國主要病毒毒原，其檢出率高達65.20%，可能由于TYLCV的傳播范圍較廣。TYLCV在熱帶、亞熱帶40多個國家大面積暴發(fā)，為世界性病害[23-25]。隨著頻繁的國際貿(mào)易活動，TYLCV傳入我國?，F(xiàn)如今，河北[26]、福建[27]、江蘇[28]、北京[29]等地區(qū)相繼發(fā)生。再加上TYLCV可通過煙粉風以持久方式進行傳播，據(jù)報道，煙粉虱能夠傳播111種雙生病毒[30]，煙粉虱在感病番茄上取食1 h，在其腸道內(nèi)可檢測出TYLCV，取食8 h后能夠?qū)⒉《境晒魅窘o其他健康植株，而且一旦獲毒可終身傳毒[31-32]。因此成為我國番茄病毒病優(yōu)勢毒源。

通過對番茄病毒復合侵染現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn)，其中2種及3種病毒復合侵染現(xiàn)象最為普遍，主要以TYLCV與ToCV、ToMV、CMV、TMV、PVY等病毒發(fā)生復合侵染，同時主要以2種病毒復合侵染為主，番茄樣品最多被5種病毒同時侵染。這可能與病毒的傳播方式以及多種茄科蔬菜的大面積種植、土壤帶毒等有關。尤其是昆蟲傳毒，如 CMV、ToCV、ToMV、TSWV等病毒均能通過蚜蟲、粉虱或薊馬等昆蟲進行病毒傳播[33-34]，部分害蟲體內(nèi)攜帶多種病毒，對植株進行刺吸傳毒后導致同一種植株上出現(xiàn)多種病毒侵染現(xiàn)象。再加上農(nóng)事栽培管理不當、品種栽培模式單一化及機械器具攜帶病毒等原因，成為番茄病毒病大規(guī)模暴發(fā)及存在交叉感染的重要因素之一。

此外，該試驗對我國不同地區(qū)進行采集樣本431份，病毒檢出率高達98.61%，僅有6份疑似感染番茄病毒病癥狀，但在該樣本內(nèi)未檢測到病毒，可能是由于番茄的一些生理性病害、蟲害或是藥害所致。

番茄病毒交叉侵染現(xiàn)象與田間雜草的互作關系息息相關，近年來已報道在我國多種雜草上存在雙生病毒的侵染[35-36]。部分學者對貴州省853份雜草樣本進行檢測，結(jié)果得出：共有179份雜草可攜帶病毒[37]。此外，葎草是病毒PVY、PVX、TMV、CMV、ToMV等初侵染源，據(jù)了解，在農(nóng)田周圍葎草上可存在7種病毒，且復合侵染的比例高達80%[38]。

本研究所檢測到的7種番茄病毒，大部分是可以通過介體昆蟲或雜草進行直接或間接性侵染傳播，而雜草常生于路邊、農(nóng)田中，極有可能成為蔬菜作物潛在的傳播源。因此，要做好番茄病毒病的相關調(diào)查，及時對番茄作物做好預防措施，并對番茄病毒病進行有效控制，減少因該病造成的經(jīng)濟損失。