石海春，陳 立，李開兵，余學(xué)杰，袁繼超，曲比伍合，柯永培

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 四川 溫江 611130; 2.四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 四川 雙流 610213;3.雅安市科學(xué)技術(shù)和知識產(chǎn)權(quán)局, 四川 雅安 625000;4.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 畢節(jié) 551700)

矮稈緊湊型玉米具有抗倒伏、耐密和適宜機械化生產(chǎn)等特點[1-4]，但目前可供利用的玉米矮稈基因資源比較單一，遺傳基礎(chǔ)狹窄，主要集中在br2[5-7]。進一步發(fā)掘新的玉米矮稈資源、加強矮化基因的鑒定與利用，為矮稈、緊湊、耐密優(yōu)良玉米雜交種的選育提供物質(zhì)和技術(shù)儲備，對玉米矮化育種具有十分重要的意義[8-13]。根據(jù)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫資料，控制玉米株高的有近250個QTLs，分布在10 條染色體上；已報道玉米矮稈單基因如br、br-2、bv和D8等60多個，大部分為隱性基因，但基因D8、D9、D(t)[14]、D*-10[15]、D11[16]等為顯性單基因，基因br-2[17]、an1[18]、D8[19]、D9[20]、d3[21]和D(t)[22]等已成功克隆。本研究以矮稈突變體K125d為主要研究材料，從主要性狀表現(xiàn)、矮稈性狀的遺傳模式、控制該矮稈性狀的基因定位與克隆等方面，進行系統(tǒng)的遺傳評價，以期明確該突變體在玉米矮化育種方向的應(yīng)用價值，為其應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

矮稈突變體K125d(P1)，7個測驗種(P2)，以及構(gòu)建的正反交F1、B1、B2和F2共6個世代群體。7個測驗種名稱及主要特征為，K211(K125d同源高稈)、K123d和626(矮稈)、K365和K363(中稈)、K305和K236(高稈)。以上材料均由四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司(以下簡稱公司)提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 K125d與K211形態(tài)差異比較 在公司四川雙流育種基地種植K125d和K211，選取有代表性的30個單株考察株高等主要農(nóng)藝性狀；成熟時，在各材料小區(qū)中間收獲有代表性的30個果穗曬干，于室內(nèi)考查主要經(jīng)濟性狀；對植株進行拍照對比。

1.2.2 K125d矮稈性狀遺傳模式分析 試驗在四川雙流和雅安2個生態(tài)點進行。其中，每個點種植P1和P2群體各36株，正反交F1群體各84株；將籽粒最多的B1和B2果穗平均分成2份，在2個點全播；F2群體每試驗點均播種336粒。對分離群體進行株高鑒定，用χ2檢驗株高分離比例適合性，確定其遺傳模式。

1.2.3 K125d矮化基因定位 定位群體為(K236×K125d)F2，在公司四川雙流育種基地播種1 400粒，為擴大定位群體規(guī)模，將上述用于遺傳模式分析的群體也用于定位使用。單株編號掛牌，分別判定高、矮株類型并登記。采用集團分離分析法(Bulked segregation analysis，BSA)[23]進行基因定位，在定位群體中各選取10株極高和極矮單株提取DNA并等量混合，構(gòu)建高稈和矮稈基因池。選取由上海生工生物工程股份有限公司合成的458對SSR引物(查自Maize Genetics and Genomics Database，http://www.maizegdb.org)，用于親本K236和K125d間的多態(tài)性引物篩選；然后在高稈和矮稈基因池間，進一步篩選多態(tài)性標記，篩選出可能與矮稈連鎖的分子標記；再用定位群體中的典型高稈和典型矮稈植株各10株進行驗證；最后用定位群體中的255個矮稈單株進行擴增。用2×CTAB法提取DNA并純化，PCR反應(yīng)體系用25 μL，PCR擴增產(chǎn)物用3% 瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)成像后觀察統(tǒng)計帶型，用MAPMAKER 3.0軟件進行連鎖分析，用MAPDraw V2.1[24]繪制遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 K125d與K211主要性狀比較

K125d與K211的植株對比見圖1，可見K125d植株葉片密集重疊，節(jié)間短、株高和穗位高較矮?？挤N結(jié)果表明，它們的果穗均為筒型、白軸、籽粒半馬齒型，K211籽粒黃色，K125d籽粒白色。將它們主要農(nóng)藝和經(jīng)濟性狀比較結(jié)果列于表1，可見，與K211相比，K125d生育期極顯著變長；株高、穗位高和葉夾角分別降低53.07%，71.46%和21.81%，均達極顯著水平；但葉片數(shù)和葉寬均極顯著增加，其增加比例分別為22.75%和15.15%，其余農(nóng)藝性狀差異不顯著；就主要經(jīng)濟性狀來看，K125d雖然穗長、穗粗和穗行數(shù)差異不顯著，但行粒數(shù)和百粒質(zhì)量卻顯著或極顯著降低，造成單株產(chǎn)量極顯著降低34.41%。

A.植株；B.莖稈；h.K211；d.K125d；標尺為10 cm。

表1 K125d與K211形態(tài)差異比較

注：±.標準誤; 2 組處理數(shù)據(jù)后的英文字母不同，則表示這2 組處理間的數(shù)據(jù)差異顯著，小寫字母代表P=0.05水平差異顯著；大寫字母代表P=0.01水平差異顯著。

Note:±.SE; If the English letters of the two groups were different，the difference between the two groups was significant difference, lowercase letters means significantly different atP=0.05；Capital letters means significantly different atP=0.01.

2.2 突變體K125d株高的遺傳分析

2.2.1 F1正反交群體株高表現(xiàn) 將K125d配制的7個F1正反交群體株高表現(xiàn)列于表2。可見，所有正反交F1群體在2個試驗點均表現(xiàn)為高稈，且正、反交群體平均株高無顯著差異，說明K125d株高遺傳表現(xiàn)無細胞質(zhì)效應(yīng)，即該矮稈性狀可能由核基因調(diào)控。另外，除用測驗種K211配制的組合K125d×K211外，測驗種株高越高，其相應(yīng)的F1群體株高也有增高趨勢，即用高稈測驗種配制的組合其平均株高高于中稈、中稈高于矮稈；雅安點F1株高比雙流點有增高的趨勢，表明F1株高由雙親遺傳背景共同控制，并受生態(tài)環(huán)境影響。

表2 正反交F1群體的株高表現(xiàn)

2.2.2 F2和回交群體的株高頻次分析 將F2和回交群體的植株高度作分布頻次分析，結(jié)果為用K125d回交的所有B1和F2群體的植株高度均表現(xiàn)為雙峰分布；B2群體(用K123d回交的B2除外)均表現(xiàn)高稈，表明K125d矮稈性狀由多基因控制的可能性不大。

2.2.3 回交群體的株高分離比例分析 將用K125d構(gòu)建的7個B1回交群體和用K123d構(gòu)建的B2回交群體的株高分離比例結(jié)果列于表3。可見，在四川雙流和雅安，7個B1回交群體均出現(xiàn)高矮分離，分離比例符合1∶1；用626、K211、K236、K305、K363和K365等測驗種構(gòu)建的6個B2回交群體在2個生態(tài)點均表現(xiàn)為高稈，表明可能由1對隱性核基因控制K125d的矮稈性狀。至于用K123d構(gòu)建的B2回交群體出現(xiàn)高矮分離，分離比例符合1∶1，其原因可能是控制K125d和K123d矮稈性狀的基因不等位。

表3 回交群體的株高表現(xiàn)χ2檢驗

注：臨界t值，χ20.05(1)=3.84,χ20.01(1)=6.63。表4同。

Note: The criticaltvalue,χ20.05(1)=3.84,χ20.01(1)=6.63.The same as Tab.4.

2.2.4 F2群體的株高分離比例分析 將用K125d構(gòu)建的7個F2群體的株高分離結(jié)果列于表4?？梢?，所有F2群體在雅安和雙流2個生態(tài)點株高分離規(guī)律表現(xiàn)一致，除(K125d×K123d)F2群體外，其余6個F2群體植株高矮分離符合3∶1，進一步表明由1對隱性核基因控制K125d的矮稈性狀。而(K125d×K123d)F2群體植株高矮分離比例為9∶7，符合2對隱性單基因控制同一性狀分離比例，表明控制K125d和K123d矮稈性狀的隱性單基因不等位。

綜合分析表明，K125d與7個不同株高自交系配制的F1正反交群體，在2個試驗點均表現(xiàn)為高稈，其對應(yīng)正、反交群體間的株高差異不明顯，證明控制K125d矮稈性狀的基因無胞質(zhì)效應(yīng)；除K123d外(br2類型)[11]，與其余6個不同株高自交系配制的B1回交群體，高、矮稈分離比例為1∶1，B2回交群體全為高稈，F(xiàn)2群體高、矮稈分離比例為3∶1，充分證明K125d的矮稈性狀受1對隱性核基因控制，暫命名為d125。用K125d和K123d構(gòu)建的回交群體B1、B2及自交F2群體，其群體植株高矮分離，比例分別為1∶1、1∶1和9∶7，符合由2對互補隱性基因控制株高遺傳表現(xiàn)的分離比例規(guī)律，表明基因d125與br2可能不等位。

表4 F2群體株高表現(xiàn)的χ2檢驗

2.3 矮稈基因d125的定位

基因定位群體為(K125d×K236)F2，選取均勻覆蓋10條玉米染色體上的SSR引物458對，篩選出在雙親間多態(tài)性較好的引物109對；進一步在高、矮稈基因池間對這109對引物進行多態(tài)性篩選，其中多態(tài)性表現(xiàn)較好的引物為umc2235。以引物umc2235分布的位置為參考，選擇并合成位于玉米第一條染色體1.05～1.09位置區(qū)間的SSR引物153對繼續(xù)進行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bnlg1619、umc1085、umc1278、umc1601、umc1689、umc1035、umc2560、umc2569和umc2387等9對引物在高、矮稈基因池間均表現(xiàn)出多態(tài)性，至此，共篩選出在高、矮基因池間具有多態(tài)性的SSR引物10對。

用上述10對SSR引物，對255個矮稈單株DNA，分別進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果照相，統(tǒng)計10對引物對定位群體中所有矮稈單株DNA擴增帶型。擴增結(jié)果連鎖分析用作圖軟件MAPMAKER 3.0，將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離用Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)化，引物與矮稈基因d125的連鎖關(guān)系用“Group”命令(LOD值大于3.0，重組率小于50%)判斷，各標記間的圖距用MAP命令計算，用MAPDraw V2.1 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。結(jié)果為，矮稈基因d125，初步定位于1號染色體上，介于umc2569和umc1278 2個SSR分子標記之間，其遺傳距離分別為6.6，5.1 cM(圖2)。

圖2 矮稈基因d125的遺傳連鎖圖譜

2.4 矮稈基因d125的克隆

根據(jù)定位結(jié)果，位于標記umc2569和umc1278附近的已知矮稈基因有5個，br2(bin 1.06)、br1(bin 1.07)、d*-N1352B(bin 1.06)、smp*-N706A(bin 1.06)和d*-N454A(bin 1.06)，在MaizeGDB中搜索相關(guān)信息發(fā)現(xiàn)僅有br2關(guān)聯(lián)有基因模型，因此以br2作為候選基因進行克隆。

根據(jù)br2基因模型GRMZM2G315375設(shè)計了8對重疊引物(圖3-A)，用于擴增br2的5個外顯子區(qū)域?？寺〗Y(jié)果如圖3-B所示，可見引物d125-8從K125d中擴增產(chǎn)物比K211約小250 bp(圖3-B中的箭頭所示)；對擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如圖3-C所示，可見d125在第1 651個堿基處有一個9 bp片段的插入，在第6 438堿基處有一個232 bp片段的缺失。通過DNAMAN對編碼序列進行翻譯顯示，d125插入的9個堿基編碼谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和甘氨酸(G)，該位置不在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)(圖3-D中三角形所示)；而缺失導(dǎo)致從第1 288個氨基酸后產(chǎn)生移碼突變(如圖3-D的箭頭所示)，該突變區(qū)域在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)的注釋為與各種細胞活動有關(guān)的ATP酶，而在P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)中為核酸結(jié)合域(Nucleotide binding domain，NBD)，該功能域功能主要是為PGP轉(zhuǎn)運提供能量。

圖3 矮稈基因d125克隆結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 矮稈突變體K125d株高的遺傳模式

玉米矮稈基因的遺傳一般分為單基因和多基因2種遺傳模式[25-26]，針對一個新的矮稈資源，常用與其他自交系構(gòu)建的F1、B1、B2和F2群體的株高分離表現(xiàn)情況，來分析判斷其遺傳模式，如張素梅等[14]于2007年就做過類似研究。本研究用矮稈突變體K125d與同源自交系K211以及2個矮稈、中稈和高稈自交系，構(gòu)建的正反交F1，回交B1、B2和自交F2群體分析其遺傳模式，結(jié)果為K125d矮稈性狀受1對隱性核基因控制，命名為d125。

3.2 矮稈基因d125初步定位結(jié)果

MaizeGDB已收錄矮稈基因60多個，定位在玉米1號染色體上的有11個?；騜r2是發(fā)現(xiàn)較早且研究較多的玉米矮稈基因，該基因與生長素的合成相關(guān)，已被成功克隆[17]。筆者將矮稈基因d125初步定位在1號染色體umc2569和umc1278 SSR分子標記之間，其距離分別為6.6,5.1 cM，在染色體上的位置與矮稈基因br2(bin 1.06)和br1(bin 1.07)等相近。

3.3 矮稈基因d125序列及功能預(yù)測

br2是目前應(yīng)用較多的玉米矮稈基因，編碼1個PGP蛋白，由兩部分組成，各部分均包含了6個假定的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細胞內(nèi)的ATP結(jié)合域，并具有各自的功能[27]。已克隆得到的br2等位基因中，br2-6、br2-7和br2-9均在外顯子1有插入，br2-3在內(nèi)含子4中有插入[17]，br2-23在第6 667個堿基處有8 bp缺失[28]，株高QTL-qph1中SNP5259(T)編碼的氨基酸帶點性質(zhì)改變可能使蛋白與底物結(jié)合能力下降[29]，高粱中與br2同源的dw3，其在外顯子5上有一個882 bp單元的直接重復(fù)，使得該基因功能缺失[17]，致使編碼蛋白功能散失。d125在第6 438堿基處缺失232 bp，包含了br2-23中的缺失部分，缺失產(chǎn)生移碼突變，這部分位于PGP蛋白和ABC轉(zhuǎn)運蛋白中的NBD內(nèi)。NBD的功能主要是為PGP轉(zhuǎn)運提供充足的能量，而保守的結(jié)構(gòu)域保證ATP結(jié)合與水解[30]，2個Walker結(jié)構(gòu)中任一個突變導(dǎo)致功能完全喪失[31]，而D125蛋白中也具有這個保守結(jié)構(gòu)。此外，NBD含有約215個氨基酸構(gòu)成的核心區(qū)，核心區(qū)內(nèi)的部分氨基酸是保守的，對整個蛋白質(zhì)的功能具有極其重要的作用[32]。Walker B附近的小片段可能直接或間接地參與底物相互作用和NBD到跨膜域間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是PGP蛋白中底物結(jié)合的主要位點[17]。d125在Walker B后移碼，造成的功能位點缺失可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)運功能喪失的主要原因。