王萍萍，霍建強(qiáng)，劉 濤，梁國(guó)平，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

己糖激酶(HXK)是植物體呼吸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用，在植物的糖感知和糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中扮演重要的角色。HXK基因家族多數(shù)成員包括9個(gè)外顯子，編碼氨基酸在492-522 aa。對(duì)HXK基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該家族成員主要分布于線粒體，少數(shù)成員存在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和質(zhì)體基質(zhì)中[1-2]。在擬南芥[3]、玉米[4]、番茄[5]和煙草[6]中進(jìn)行的試驗(yàn)表明，大多數(shù)HXK1 蛋白與線粒體外膜結(jié)合，在糖酵解中發(fā)揮作用[7]。己糖激酶催化己糖的磷酸化，不僅對(duì)葡萄糖具有磷酸化作用，而且對(duì)果糖也具有磷酸化。在植物中己糖激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和催化功能并不偶聯(lián)，因此可將依賴于己糖激酶的葡萄糖磷酸化從依賴于己糖激酶的葡萄糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中區(qū)分出來(lái)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，失去磷酸化催化活力的轉(zhuǎn)基因植株仍表現(xiàn)出正常的糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[9]。己糖激酶作為細(xì)胞內(nèi)糖傳感蛋白，在葡萄糖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的功能，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育與基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制復(fù)雜[10]。目前在擬南芥[11]、玉米[12]、水稻[13]、菠菜[14]和番茄[15]等植物中克隆獲得了HXK基因，均表明在糖代謝和糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。

擬南芥中HXK基因家族有6個(gè)成員，其中3個(gè)基因編碼具有催化活性的蛋白質(zhì)，包括基質(zhì)局部的HXK3的蛋白，主要是在庫(kù)器官中表達(dá)。另外3個(gè)基因編碼的HKL蛋白約有50%與AtHXK1的相同，但是不能使葡萄糖和果糖磷酸化。HKL1與HKL2轉(zhuǎn)錄發(fā)生在大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)的線粒體中，并不是全部。HKL3轉(zhuǎn)錄只在花中檢測(cè)到，該蛋白質(zhì)的缺乏可使其他許多氨基酸發(fā)生變化，可能危及其能力甚至葡萄糖或ATP的結(jié)合能力[12]。玉米中HXK基因家族有9個(gè)成員，多序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析表明，玉米ZmHXK蛋白在3個(gè)結(jié)構(gòu)域中共享；研究表明，ZmHXK5在雄穗中高度表達(dá)，而ZmHXK6在雄穗和葉子都有表達(dá)。ZmHXK5和ZmHXK6表達(dá)水平是使得植物激素和非生物脅迫上調(diào)[13]。水稻中HXK基因家族除OsHXK1是單外顯子外，其他9個(gè)具有高度保守的基因組結(jié)構(gòu)，都含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子?；虮磉_(dá)譜分子顯示，OsHXK2～OsHXK9在各種器官中表達(dá)，而OsHXK10卻在特殊花粉中表達(dá)。OsHXK2、OsHXK5和OsHXK6在離體的葉片中表達(dá)，而抑制了OsHXK7在離體葉片和未成熟種子中的表達(dá)。OsHXK4是質(zhì)體基質(zhì)有針對(duì)性的己糖激酶，而OsHXK7定位于細(xì)胞質(zhì)中,作為Moonlight蛋白的構(gòu)象特征參與糖信號(hào)和代謝[14]。

目前葡萄基因組測(cè)序已完成(http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)，但是葡萄中HXK基因家族的研究還未見相關(guān)的報(bào)道，因此，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)得到的葡萄HXK基因家族進(jìn)行生物信息分析，并通過(guò)qRT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)葡萄HXK基因在同一濃度不同糖、同一糖不同濃度處理下的表達(dá)進(jìn)行分析，為葡萄品質(zhì)改良提供候選基因，并為深入研究葡萄糖代謝機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紅地球葡萄(VitisviniferaRed Globe)試管苗，來(lái)源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生理生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的處理 將健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致且無(wú)污染的紅地球試管苗，剪成單芽莖段(2～3 cm)并留1片葉，轉(zhuǎn)接在MS固體培養(yǎng)基上，試驗(yàn)材料用同一濃度不同糖(葡萄糖、蔗糖和果糖均為20 g/L)和同一糖不同質(zhì)量濃度(葡萄糖濃度分別為10，20，40 g/L)進(jìn)行處理，其他成分均相同，不加任何糖的作為對(duì)照，處理至第40天后分別取不同處理的葉片提取RNA，做實(shí)時(shí)熒光定量分析。

1.2.2 葡萄RNA的提取、cDNA的合成及引物設(shè)計(jì)

1.2.2.1 RNA的提取 參考申鵬[16]方法對(duì)紅地球試管苗進(jìn)行RNA的提取，RNA試劑盒購(gòu)自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

1.2.2.2 cDNA的合成 采用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser(Perfect Real Time)，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2.2.3 引物設(shè)計(jì) 采用Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 葡萄HXK基因的分離與克隆 從相關(guān)文獻(xiàn)中查到擬南芥、玉米、水稻、煙草、馬鈴薯及柑橘等的HXK基因的登錄號(hào)，將其登錄號(hào)輸入NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)得到各自的CDS、cDNA等，通過(guò)Blast server(http://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/)得到各自相關(guān)序列，然后將得到的各自的序列輸入葡萄基因庫(kù)Grape Genome Browser(http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)，電子克隆出其相應(yīng)葡萄HXK基因的序列，并在DNAMAN中將所得的堿基序列逐一的對(duì)比并對(duì)其進(jìn)行篩選，最后只得到4個(gè)葡萄HXK基因，分別命名為VvHXK1、VvHXK2、VvHXK3、VvHXK4。

1.2.4 葡萄HXK基因的生物信息學(xué)分析 用EXPASY-Translate tool(http://web.expasy.org/translate/)將VvHXK堿基序列翻譯為氨基酸序列，將氨基酸序列輸入EXPASY-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)中，對(duì)VvHXK基因的氨基酸數(shù)目、理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量進(jìn)行分析。將葡萄HXK的堿基序列和氨基酸序列輸入Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)中對(duì)其外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行分析。利用軟件Mega 5和ClustalW構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)VvHXK基因的氨基酸序列的保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html和https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html對(duì)葡萄HXK基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位和HXK基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan)，以葡萄HXK基因家族起始密碼子上游2 000 bp的堿基為序列，對(duì)VvHXK基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在Premier 5.0中用所得的4個(gè)VvHXK基因的CDS序列進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，如表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)，用Bio-Rad iCycleriQ實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以葡萄UBI基因?yàn)閮?nèi)參[17]，對(duì)所得的4個(gè)VvHXK基因家族進(jìn)行特異性表達(dá)分析。

表1 VvHXK基因家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄HXK基因在染色體上的分布

如圖1所示，得到的4條VvHXK基因位于葡萄不同的染色體上，VvHXK1、VvHXK2、VvHXK3、VvHXK4分別位于葡萄的第9，11，18，6號(hào)染色體上且它們存在的位置各不相同。

2.2 葡萄HXK 基因外顯子的結(jié)構(gòu)

從圖2 的基因結(jié)構(gòu)中可看出，4個(gè)基因的外顯子都分布在其序列的9 kb以內(nèi)，其中VvHXK3的序列最短；除VvHXK1含有10個(gè)外顯子(多了最后一個(gè)長(zhǎng)度僅為48 bp的外顯子)外，VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4都有9個(gè)外顯子，4個(gè)基因除了個(gè)別外顯子的長(zhǎng)度不一樣外其余的長(zhǎng)度均一樣，比如4個(gè)基因都含有151，183，75，156，82 bp大小的外顯子。VvHXK1與VvHXK2基因前8個(gè)外顯子大小相同，VvHXK4基因的第一個(gè)外顯子長(zhǎng)度為272 bp，比其他3個(gè)基因第一個(gè)外顯子都大，且VvHXK4基因含有4個(gè)基因中最大的一個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為426 bp。從基因結(jié)構(gòu)圖可以看出葡萄HXK基因的外顯子在這個(gè)區(qū)間的分布是保守的。

圖1 葡萄基因HXK在染色體上的分布

圖2 葡萄HXK基因家族的基因結(jié)構(gòu)

2.3 葡萄HXK基因編碼蛋白理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)

表2結(jié)果表明，除了VvHXK4編碼的氨基酸個(gè)數(shù)為524 aa外，其余3個(gè)編碼氨基酸較少，都在412-449 aa，每個(gè)基因編碼的氨基酸數(shù)目相差不多；VvHXK基因家族的等電點(diǎn)在5.03～8.27，除了VvHXK4的等電點(diǎn)為8.27是堿性外，其余3個(gè)均小于7，即為酸性氨基酸；VvHXK4基因的分子質(zhì)量最大為56.818 1 ku，而VvHXK3最小，僅為4.490 4 ku，VvHXK1和VvHXK2的分子質(zhì)量幾乎接近。

從表3的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可看出，4個(gè)VvHXK基因編碼的蛋白均主要以α-螺旋為主，不規(guī)則卷曲次之，VvHXK1的不規(guī)則卷曲幾乎接近α-螺旋，其他的均相距較大，β-轉(zhuǎn)角占比最少，均在10%左右。

表3 葡萄HXK蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.4 葡萄HXK亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

表4表明，這4個(gè)VvHXK基因全在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；VvHXK2和VvHXK3不在葉綠體中表達(dá)，其余2個(gè)均在葉綠體中表達(dá)，但VvHXK2在線粒體和細(xì)胞核中表達(dá)，而其他均在線粒體和細(xì)胞核中沒有表達(dá)；VvHXK1在細(xì)胞膜和液泡中表達(dá)，其他均不在細(xì)胞膜和液泡內(nèi)表達(dá)；VvHXK2和VvHXK3還在細(xì)胞骨架中表達(dá)，VvHXK4主要定位于葉綠體。

表4 葡萄HXK基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.5 葡萄HXK基因上游2 kb區(qū)域順式作用元件分析

表5表明，在該基因家族起始密碼子上游2 kb堿基序列中每個(gè)基因都含有ABA響應(yīng)元件(ABRE)，其中VvHXK3中最多；每個(gè)基因中都有MYB轉(zhuǎn)錄因子且分布幾乎一致；每個(gè)基因中WRKY轉(zhuǎn)錄因子比MYB因子少，但均有分布；VvHXK1和VvHXK4中沒有脫水應(yīng)答元件(DRE)，VvHXK3中DRE比VvXHK2多；VvHXK4中沒有低溫響應(yīng)元件(LTRE)，VvHXK3中分布的LTRE較其他3個(gè)多。

表5 VvHXK基因上游2 kb區(qū)域順式作用元件的分布

2.6 葡萄HXK基因編碼的氨基酸序列的進(jìn)化分析

本研究對(duì)葡萄4個(gè)HXK基因與已經(jīng)鑒定出的擬南芥、水稻、玉米、馬鈴薯、菠菜、煙草和柑橘的氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系(圖3)進(jìn)行了分析。從圖中可以明顯發(fā)現(xiàn)它們分為3組，第1組可以分為2個(gè)小組，第1組(Group 1)中的Group 1-1中包含VvHXK1，它與擬南芥的同源關(guān)系最近，Group 1-2中包含VvHXK2，它與馬鈴薯的同源關(guān)系最近，其次與菠菜的同源關(guān)系較近。第2組(Group 2)包含VvHXK3，與馬鈴薯同源關(guān)系最近，其次與煙草較近。第3組(Group 3)包含VvHXK4，同源關(guān)系與菠菜最近，其次與柑橘和玉米的同源關(guān)系較近。圖3表明，只有VvHXK1與擬南芥AtHXK1的同源關(guān)系相對(duì)較近，VvHXK2和VvHXK3與玉米和水稻的同源關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，而VvHXK4與玉米和水稻的同源關(guān)系相對(duì)較近。

圖3 擬南芥、水稻、玉米和葡萄HXK基因進(jìn)化樹

2.7 葡萄HXK基因的qRT-PCR分析

在熒光定量表達(dá)分析中，只得到了基因VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4的表達(dá)量。圖4-A表明，在同一葡萄糖不同濃度處理下，3個(gè)基因均在20 g/L葡萄糖處理下的表達(dá)量最高，VvHXK3和VvHXK4的表達(dá)量高達(dá)70.944 0%和64.641 8%，VvHXK3的表達(dá)量比VvHXK2的高達(dá)10倍左右；在10 g/L的處理下，VvHXK2和VvHXK4的表達(dá)量高于對(duì)照，而VvHXK3的表達(dá)量低于對(duì)照；只有VvHXK2在40 g/L葡萄糖處理下的表達(dá)量高于對(duì)照，其他2個(gè)均低于對(duì)照。

圖4-B表明，在同一濃度不同糖的處理下，3個(gè)基因均在20 g/L葡萄糖處理下的相對(duì)表達(dá)量最高，VvHXK2的表達(dá)量較低些，約為7.5%，VvHXK3的表達(dá)量最高，為70.0%，VvHXK4次之；經(jīng)果糖(F20)與蔗糖(S20)處理，3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量接近且均低于對(duì)照，VvHXK2分別被20 g/L的果糖和蔗糖處理后，其表達(dá)量比葡萄糖(G20)處理的低了9倍左右；VvHXK3被20 g/L的果糖與蔗糖處理之后，表達(dá)量都在0.5%左右，而葡萄糖處理后表達(dá)量高達(dá)70%，相差很大；VvHXK4被濃度為20 g/L的葡萄糖處理后，相對(duì)表達(dá)量為62.0%，果糖、蔗糖處理后，VvHXK4的相對(duì)表達(dá)量為0.8%，0.5%，差距也是非常顯著；在VvHXK2和VvHXK4中，果糖和蔗糖處理的相對(duì)表達(dá)量雖低于對(duì)照，但比VvHXK3的表達(dá)量高。從圖中可看出，20 g/L葡萄糖處理后的VvHXK3相對(duì)表達(dá)量最高，VvHXK4次之，VvHXK2最低。

圖4 VvHXK基因在不同糖處理中的熒光定量PCR分析

3 討論與結(jié)論

己糖激酶(HXK)與植物糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有直接的關(guān)聯(lián)。Olsson等[18]根據(jù)其N末端氨基酸序列將植物HXK基因分為A型和B型，A型HXK約有30個(gè)氨基酸葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽；而B型HXK約有24個(gè)氨基酸且有一個(gè)共同的N端疏水性膜的錨域，可能與細(xì)胞膜相關(guān)聯(lián)。Anders等[19]發(fā)現(xiàn)HXK基因除了類型A和B，中歐葫蘆蘚屬中有C型和D型2個(gè)新類型，C型由單一基因編碼，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。D型由3個(gè)基因編碼，與線粒體相關(guān)聯(lián)，但它們的序列不同于B型。研究表明，擬南芥AtHXK1和AtHXK2，番茄SlHXK1、SlHXK2、SlHXK3，煙草NtHXK1，水稻OsHXK2、OsHXK3、OsHXK5、OsHXK6和OsHXK9，高粱SbHXK3，菠菜SoHXK1與線粒體相關(guān)聯(lián)，而單子葉植物水稻中OsHXK1、OsHXK7、OsHXK8和OsHXK10定位于細(xì)胞質(zhì)[20-21]，除此之外還定位于葉綠體[22]和液泡[23]中。本研究表明，得到的4個(gè)VvHXK基因均在細(xì)胞質(zhì)中有所表達(dá)；VvHXK4主要在葉綠體中表達(dá)，VvHXK2在線粒體和細(xì)胞核中表達(dá)；VvHXK1在細(xì)胞膜和液泡中表達(dá)。

在擬南芥、水稻及玉米中，大部分 HXK同源基因都具有9個(gè)外顯子，但是成員間內(nèi)含子長(zhǎng)短的差異比較大[11-13]。本研究中的4個(gè)VvXHK基因，除了VvHXK1含有10個(gè)外顯子，其他3個(gè)都含有9個(gè)外顯子，成員間的差異不大。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析研究中，趙錦等[24]發(fā)現(xiàn)蘋果MdHXK1與葡萄(AEJ95926.1)的同源性較高，高達(dá)85%。雍彬等[25]發(fā)現(xiàn)甘薯HXK基因與番茄、馬鈴薯和煙草的親緣關(guān)系最近，與擬南芥相對(duì)較遠(yuǎn)。水稻中OsHXK2與AtHXK1和AtHXK2同源性較高，OsHXK4與NtHXK2親緣關(guān)系較近。帥良等[26]通過(guò)對(duì)其預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列與其他植物中HXK基因的相似性分析發(fā)現(xiàn)，龍眼DlHXK與番茄(NP_00124710)、枇杷(ADZ963781)、煙草(AAS601951)等物種相似性分別達(dá)到了71%，74%，71%，DlHXK基因與溫州蜜柑(AAG285031)相似性最高，達(dá)到了82%。本研究表明，葡萄VvHXK1與擬南芥AtHXK1進(jìn)化關(guān)系最為接近，推測(cè)二者功能相近，除了調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用和植物生長(zhǎng)，VvHXK1也會(huì)加速衰老，提高側(cè)芽的外觀，影響根系的生長(zhǎng)，氣孔關(guān)閉和控制蒸騰[27-28]。VvHXK2與馬鈴薯StHXK1的同源關(guān)系最近，其次與煙草NtHXK1較近，推測(cè)VvHXK2能使葉提取物或葉綠體中的葡萄糖磷酸化活性升高，也可接替葡萄糖傳感功能。VvHXK3與馬鈴薯StHXKRP1的同源關(guān)系最近，與OsHXK2的同源關(guān)系較近，即VvHXK2也許能夠誘導(dǎo)離體葉片中糖的表達(dá)。VvHXK4與菠菜SoHXK1的同源關(guān)系最近，SoHXK1是B型HXK唯一的例外，即一直定位于葉綠體的外膜，這與VvHXK4定位于葉綠體是一樣的[29]。

研究表明，AtHXK1可能是一個(gè)保守的葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)，作為傳感器并直接響應(yīng)葡萄糖存在。馬鈴薯的StHXK1、StHXK2和水稻OsHXK5、OsHXK6的表達(dá)在擬南芥植物缺乏AtHXK1(gin2突變)時(shí)補(bǔ)充了葡萄糖敏感，以此推測(cè)它們?cè)谔歉兄械淖饔肹30]。對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，AtHXK1、AtHXK2和AtHXK3編碼的蛋白質(zhì)有葡萄糖激酶的活性，其中AtHXK1和AtHXK2都顯示具有催化活性，而AtHXK3的葡萄糖磷酸化是與眾不同的，因?yàn)锳tHXK3還可以磷酸化果糖[12]。本研究結(jié)果表明，在20 g/L葡萄糖處理下3個(gè)VvHXK基因的相對(duì)表達(dá)量最高，其他濃度下均較低，且達(dá)到40 g/L時(shí)幾乎不表達(dá)，即當(dāng)葡萄糖達(dá)到20g/L左右時(shí)VvHXK基因?qū)ζ咸烟堑拇呋钚宰罡?，其他濃度下表達(dá)都較低，但VvHXK2的催化活性低于VvHXK3和VvHXK4，這可能與植物體內(nèi)糖代謝葡萄糖含量有關(guān)。在同一濃度不同糖處理下，VvHXK基因只有葡萄糖處理下表達(dá)，蔗糖和果糖的表達(dá)均低于對(duì)照，即此可能與葡萄體內(nèi)糖代謝時(shí)的代謝底物有關(guān)。

在同一濃度不同糖處理下，3個(gè)VvHXK基因均在20 g/L葡萄糖處理下表達(dá)量高，蔗糖和果糖的表達(dá)均低于對(duì)照，這可能與植物體內(nèi)糖代謝時(shí)的代謝底物有關(guān)。由此可知VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4磷酸化的均是葡萄糖，而不磷酸化果糖和蔗糖，即對(duì)果糖和蔗糖不起催化作用。

由試驗(yàn)可得出結(jié)論：分別定位于葡萄19條染色體中9，11，18，6號(hào)染色體上的VvHXK1、VvHXK2、VvHXK3、VvHXK4基因，經(jīng)過(guò)不同的試驗(yàn)處理，結(jié)果表明，除了VvHXK1基因不表達(dá)，VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4均在20 g/L的葡萄糖處理下表達(dá)量最高，編碼的蛋白質(zhì)活性最強(qiáng)。