朱俊,陳雨舟,陳云飛,李連波,周殷,蘇程果,周海燕,趙陽

(1.成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院/第三附屬醫(yī)院,成都 610075;2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海 200437)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是以外周關節(jié)滑膜炎癥為特征的免疫性疾病,在我國的發(fā)病人數(shù)約有400多萬人[1-2]。關節(jié)滑膜炎癥產(chǎn)生的炎癥細胞因子誘導滑膜細胞過度增殖,并產(chǎn)生血管翳侵蝕軟骨表面,造成骨和軟骨的破壞,導致 RA患者病情進一步惡化?；|(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3, MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶超家族,促進滑膜細胞異常增殖,在 RA病情進展中起著關鍵作用[3-5]。

課題組研究證實,電針配合常規(guī)藥物治療RA患者有較好的臨床療效;電針干預可以顯著控制關節(jié)炎大鼠模型的病情進展,減輕炎癥的程度[6-7]。本次研究是在既往研究的基礎上,以佐劑性關節(jié)炎大鼠(Adjuvant arthritis, AA)模型為研究對象,觀察電針干預對關節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎癥和滑膜細胞凋亡的影響情況,以及滑膜局部 MMP-3、MMP-9的 mRNA和蛋白表達水平,深入探討電針干預RA關節(jié)炎癥的分子機制,為臨床上電針治療RA提供新的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及倫理

SPF級雄性SD大鼠32只(成都達碩動物有限責任公司提供),6周齡,飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院/第三附屬醫(yī)院實驗中心動物房。適應性飼養(yǎng) 1周,大鼠可以自由飲水、飲食、活動。標準光照周期(12 h光照/12 h黑暗),室內(nèi)溫度為(24±2)℃,濕度(65±10)%。

本實驗研究通過成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理編號2018-05),動物實驗根據(jù)3Rs原則以及NIH動物護理和指南進行。

1.1.2 試劑

弗氏完全佐劑(批號F-5881),美國Sigma公司;一抗(MMP-3,批號ab52915;MMP-9,批號ab38898),Abcam公司;Tunnel試劑盒(批號11684817910),Roche公司。

1.1.3 設備

電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠,型號 SDZ-Ⅱ),超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物,型號 JY92-Ⅱn),臺式高速冷凍離心機(Heal Force,型號 Neofuge 15R),全自動研磨儀(賽維爾生物,型號 KH-Ⅲ),熒光定量 PCR擴增儀(美國 Bio-Rad,型號 CFX96),Trans-Blot?Turbo? Transfer System(美國 Bio-Rad),光學顯微鏡(日本Olympus公司,型號BX51)。

1.2 分組及造模

32只SD大鼠被隨機分為生理鹽水組、模型組、電針干預組和假電針干預組,每組 8只。參考 Zhu J等[7],生理鹽水組大鼠用0.1 mL生理鹽水模擬造模,其余各組大鼠的雙側足墊內(nèi)分別用0.1 mL弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant CFA)注射進行造模。

關節(jié)炎模型的評價[8],分為0～4分,0分為大鼠踝關節(jié)無腫脹,無顏色改變;1分為大鼠踝關節(jié)皮膚鮮紅色且輕度腫脹;2分為大鼠踝關節(jié)出現(xiàn)明顯的紅腫,但未出現(xiàn)足趾變形;3分為大鼠踝關節(jié)至足趾部位嚴重紅腫,足趾無跖曲;4分為大鼠踝關節(jié)至足趾部位嚴重紅腫,足趾跖曲,且不能負重。評分≥3分即為造模成功。

1.3 電針治療方式

參考Zhu J等[7]文獻,造模后3 d開始,電針干預組大鼠固定后,取雙側足三里穴(ST36,后肢膝關節(jié)后外側,腓骨小頭下約5 mm處)和懸鐘穴(GB39,后肢外踝尖上10 mm處),局部消毒處理,用0.25 mm×25 mm毫針針刺,足三里穴針刺深度為7 mm,懸鐘穴約3 mm;接電針儀正、負電極,刺激參數(shù)為電壓3 V,連續(xù)波,頻率2 Hz,15 min,針刺強度以針身微微跳動而大鼠處于安靜狀態(tài)為宜。每2天1次,共計8次。

假電針干預組大鼠在足三里、懸鐘穴旁5 mm處予以0.25 mm×25 mm毫針輕輕透皮但不刺入肌肉內(nèi),刺激強度與電針干預組相同。生理鹽水組和模型組大鼠予以自制大鼠固定器固定,不予其他干預。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 標本收集

在實驗第18天,所有大鼠禁食24 h后被麻醉脫臼處死,取左側踝關節(jié)做HE染色觀察和Tunnel觀察,右側踝關節(jié)滑膜組織做RT-PCR和Western blot檢測。

1.4.2 踝關節(jié)病理形態(tài)學

踝關節(jié)滑膜組織予以脫鈣、脫水,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,封片,光鏡下(×200)觀察踝關節(jié)的病理形態(tài)學改變。

1.4.3 滑膜細胞凋亡觀察

滑膜細胞凋亡采用Tunnel法進行檢測,4 μm石蠟切片脫蠟至水,修復,破膜,取Tunnel試劑盒內(nèi)適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按1:9混合,加到對應組織,DAPI復染細胞核,抗熒光淬滅封片劑封片,切片于(×200)熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色,陽性凋亡細胞核為綠色。

1.4.4 滑膜MMP-3、MMP-9基因表達

采用RT-PCR檢測滑膜MMP-3、MMP-9的mRNA表達水平。踝關節(jié)滑膜組織制備勻漿,加入200 μL氯仿提取總RNA,RNA沉淀后,加入適量DEPC處理水完全溶解后得到總RNA,采用核酸定量儀對RNA的純度及降解情況進行測定。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄反應體系進行反轉(zhuǎn)錄,后進行熒光定量PCR反應體系測定RNA表達情況。反應條件為預變性溫度 95℃,時間 2 min,循環(huán) 1次;變性溫度95℃,時間10 s;退火溫度Tm,30 s,循環(huán)40次,延伸溫度95℃,時間10 s;60℃,1 min,95℃,15 s。檢測結果取三孔的平均值。基因序列見表1。

1.4.5 滑膜MMP-3、MMP-9蛋白表達

采用Western Blot檢測滑膜MMP-3、MMP-9蛋白表達水平?；そM織樣品制備,BCA蛋白定量檢測,10 μL移液器上樣,90 V恒壓凝膠電泳;取出PVDF膜,與一抗(MMP-3,1:200;MMP-9,1:200)雜交,ECL顯影,膠片掃描,Image J軟件分析其灰度值。

表1 MMP-3、MMP-9、GAPDH基因序列

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,方差齊性者采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠踝關節(jié)病理形態(tài)情況

如圖1所示,生理鹽水組大鼠踝關節(jié)滑膜組織細胞呈單層排列,無炎性細胞浸潤和滑膜細胞增生。模型組和假電針干預組大鼠踝關節(jié)滑膜細胞呈過度增殖狀態(tài),炎性細胞顯著增多。電針干預組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中滑膜細胞增生程度顯著低于模型組和假電針干預組,且炎性細胞數(shù)較少。

2.2 大鼠踝關節(jié)滑膜細胞凋亡情況

如圖2所示,綠色顯影即代表凋亡細胞數(shù)量,藍色顯影代表正常細胞數(shù)量。生理鹽水組大鼠踝關節(jié)滑膜細胞僅存在少量的陽性凋亡細胞,模型組大鼠踝關節(jié)滑膜陽性凋亡細胞數(shù)量顯著多于生理鹽水組,假電針干預組的陽性細胞數(shù)量與模型組相比無明顯差異,電針干預組大鼠的陽性細胞大量表達,高于其余各組。

圖1 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織病理形態(tài)情況(光學顯微鏡,×200)

2.3 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織 MMP-3、MMP-9 mRNA表達

統(tǒng)計結果顯示,MMP-3、MMP-9 mRNA表達在不同組別之間存在顯著性差異(P=0.001,P=0.001)。如圖 3A所示,MMP-3在模型組中的表達為43.78±23.61,顯著高于其在生理鹽水組的表達 1.70±0.82(P=0.008);MMP-3在電針干預組中的表達為12.65±6.55,顯著低于其在模型組的表達情況(P=0.036);MMP-3在假電針干預組中的表達為 28.72±15.17,與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.586),MMP-3在電針干預組的表達顯著低于假電針干預組的表達水平(P=0.034)。

如圖3B所示MMP-9在模型組中的表達為120.76±55.73,顯著高于生理鹽水組的 1.64±1.01(P=0.003);MMP-9在電針干預組中的表達為 8.78±3.67,顯著低于其在模型組的表達水平(P=0.004);MMP-9在假電針干預組中的表達為 73.49±30.10,與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.283)。MMP-9在電針干預組的表達顯著低于假電針干預組的表達(P=0.002)。

2.4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織MMP-3、MMP-9蛋白表達

統(tǒng)計結果顯示,MMP-3、MMP-9蛋白表達在不同組別之間存在顯著性差異(P=0.001,P=0.001)。如圖 4A所示,MMP-3在模型組中的表達為0.88±0.30,顯著高于其在生理鹽水組的表達 0.24±0.15(P=0.001);MMP-3在電針干預組中的表達為 0.49±0.28,顯著低于其在模型組的表達水平(P=0.012);MMP-3在假電針干預組中的表達為 0.79±0.37,與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.549)。MMP-3在電針干預組中的表達顯著低于其在假電針干預組的表達水平(P=0.048)。

圖2 各組大鼠踝關節(jié)滑膜細胞凋亡情況(熒光顯微鏡,×200)

圖3 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織MMP-3、MMP-9 mRNA表達(,n=8)

如圖4B所示,MMP-9在模型組中的表達為0.93±0.29,顯著高于其在生理鹽水組的表達 0.27±0.19(P=0.001);MMP-9在電針干預組中的表達為 0.48±0.17,顯著低于其在模型組的表達水平(P=0.001);MMP-9在假電針干預組中的表達為 0.83±0.34,與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.449)。MMP-9在電針干預組中的表達顯著低于其在假電針干預組的表達水平(P=0.010)。Western blot檢測各組大鼠 MMP-3、MMP-9的表達情況見圖5。

圖4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織MMP-3、MMP-9蛋白表達(,n=8)

圖5 Western BIot檢測各組大鼠MMP-3、MMP-9的表達情況

3 討論

類風濕關節(jié)炎屬于中醫(yī)學“痹證”范疇,其病機多為本虛標實。臨床研究證實,電針治療可以顯著抑制RA患者的關節(jié)疼痛、腫脹等情況,改善患者的生活質(zhì)量,控制病情進展[9-10]。電針能有效降低RA患者外周血和關節(jié)滑液中炎性細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF的表達水平,提高抑炎性細胞因子IL-4、IL-10的表達水平,改善RA患者的免疫平衡狀態(tài)[11-12]。

動物實驗也證實電針干預可以顯著抑制關節(jié)炎大鼠模型的炎癥進展[13]。電針能夠上調(diào)RA大鼠下丘腦和脊髓腺苷 A1受體的表達,實現(xiàn)其鎮(zhèn)痛效應;電針可能上調(diào)滑膜β-END和 MOR、KOR、DOR表達水平,實現(xiàn)對RA大鼠的疼痛干預效應[14-16]。在系統(tǒng)免疫方面,電針足三里、懸鐘穴可以顯著改善RA動物模型的系統(tǒng)性炎癥,降低CD4+IL-17+Th17細胞在脾臟中的表達數(shù)量,增加Foxp3+Treg細胞的表達數(shù)量,改善機體內(nèi)的免疫平衡狀態(tài),減輕外周炎性細胞因子的表達水平[13]。在關節(jié)炎癥局部,電針足三里、懸鐘穴可以顯著抑制滑膜局部炎癥細胞浸潤[17]。這些研究從干預系統(tǒng)性炎癥、局部炎癥和鎮(zhèn)痛角度進行闡釋,而對異常增殖的滑膜細胞本身的關注較少。本次研究是在此基礎之上,進一步探討電針干預對關節(jié)炎異常增殖的滑膜細胞的影響情況。

異常增殖的滑膜細胞是 RA關節(jié)炎癥和血管翳形成的核心環(huán)節(jié)[18]。低氧導致滑膜細胞處于缺氧狀態(tài),進而導致滑膜組織內(nèi)出現(xiàn)異常的新生血管,將炎性細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等帶入滑膜組織內(nèi),導致滑膜細胞出現(xiàn)炎性反應而過度增殖,導致RA病情進一步加重。因而促進異常增殖的滑膜細胞凋亡是控制 RA病情進展的關鍵所在。筆者前期研究證實電針可以抑制關節(jié)炎大鼠的滑膜新生血管的標志物CD34的表達,減少新生血管形成,減輕關節(jié)炎癥的發(fā)生[7]。Tunnel顯示電針干預組的免疫熒光數(shù)高于模型組和假電針干預組,HE染色顯示,電針干預組大鼠的關節(jié)炎癥顯著輕于模型組。提示電針可以顯著促進增殖的滑膜細胞凋亡,進而抑制了模型大鼠的關節(jié)炎癥發(fā)生,這與我們的前期研究結果相吻合。

MMP-3和MMP-9在RA發(fā)病過程中起著關鍵的作用,可以促進滑膜細胞的異常增殖和軟骨的破壞[19]。MMP-3和MMP-9在RA患者外周血中均被檢測出高表達水平,且與RA病情的嚴重程度呈正相關性,甚至導致關節(jié)軟骨出現(xiàn)破壞[20]。MMP-3和MMP-9的表達與滑膜細胞增殖呈現(xiàn)出密切的相關性,控制MMP-3和MMP-9在滑膜局部的表達可以有效地促進滑膜細胞的凋亡[21-23]。本次實驗研究證實,電針干預可以顯著地降低 MMP-3和MMP-9的基因和蛋白表達水平。在其他類型的疾病動物模型中,電針干預對MMP-3和MMP-9的表達也顯示出類似的趨勢[24-26]。這些研究情況與本實驗研究結果一致。

假電針干預是目前針刺研究中的熱點問題。臨床研究顯示,電針經(jīng)穴相對于在非經(jīng)非穴處進行電針干預,可以更加有效地改善RA患者的生活質(zhì)量[9];而相同方式的臨床研究顯示,電針可以更有效地改善老年便秘患者的癥狀[27]。在動物實驗中,相比于非經(jīng)穴處電針干預,電針特定穴位預處理能更加有效地提高敗血癥模型小鼠的存活率[28]。本研究選用在大鼠足三里、懸鐘穴旁開進行經(jīng)皮電刺激,結果與前期的文獻報道一致,電針干預對AA大鼠MMP-3和MMP-9的抑制作用顯著優(yōu)于假電針干預組。顯示出電針干預的有效性。

綜上所述,電針干預可以顯著促進AA大鼠的滑膜細胞凋亡,其作用機制可能通過降低 MMP-3和 MMP-9的表達實現(xiàn)。然而本次研究沒有用阻斷劑阻斷來驗證電針的干預效應,對細胞凋亡的數(shù)量未進行半定量分析,這些是本次實驗不足的地方。在進一步的研究中,筆者將繼續(xù)圍繞滑膜細胞凋亡的相關分子機制進行分析,為電針臨床治療RA提供更加有力可靠的實驗依據(jù)。