徐敏 黃攀 何曉英

(1德陽(yáng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)外科，四川 德陽(yáng) 618000；2德陽(yáng)市人民醫(yī)院；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Neuroglioma)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50%，發(fā)病率和死亡率均較高〔1〕，手術(shù)切除是目前最主要的治療方式，然而由于腫瘤細(xì)胞常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織邊界不明顯，手術(shù)常難以完全清除干凈，因此，積極探索更加有效的治療方式極有必要〔2〕。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)發(fā)展模式已經(jīng)從對(duì)癥治療轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)因治療，因此只有將神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制研究得更加透徹才能尋找到更加有效的治療方式〔3〕。microRNA是一類長(zhǎng)度17～22個(gè)核苷酸序列的非編碼小分子物質(zhì)，可通過與靶基因的mRNA結(jié)合進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄后翻譯的過程從而發(fā)揮調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生的作用〔4〕。microRNA-21是一種與腫瘤關(guān)系密切的小分子RNA〔5〕，研究顯示在多種實(shí)體腫瘤的病理組織或外周血中均存在microRNA-21的表達(dá)量增高〔6〕。然而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中microRNA-21的表達(dá)情況及microRNA-21的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未見報(bào)道。本研究擬通過RT-PCR技術(shù)及生物信息學(xué)分析的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇德陽(yáng)市第二人民醫(yī)院收治的確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者53例作為試驗(yàn)組，年齡31～68歲，平均(39.68±8.72)歲，男28例，女25例；另選取同期健康體檢者50例，年齡(40.24±8.84)歲，男25例，女25例。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合中國(guó)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南者〔7〕；②臨床資料完整者；③神志清楚能配合研究者；④知情同意；⑤首次確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤者。排除標(biāo)準(zhǔn) ①非首次確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤或已經(jīng)治療的神經(jīng)膠質(zhì)瘤者；②嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；③精神異常不能配合者。

1.3標(biāo)本采集 入院時(shí)對(duì)疑診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的患者采集空腹外周靜脈血，室溫靜置15 min后離心分離收集上層血清并編號(hào)，保存于-80℃冰箱用于后期的RT-PCR；若術(shù)后病理證實(shí)為非神經(jīng)膠質(zhì)瘤則剔除對(duì)應(yīng)編號(hào)的血清樣本。

1.4主要試劑與儀器 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、Trizol Reagent、10 mmol/L dNTP MIX均購(gòu)于美國(guó)InvitrogenTM公司；內(nèi)參基因U6及microRNA-21引物序列由武漢金德生物科技有限公司設(shè)計(jì)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)于美國(guó)TaKaRa公司；PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司；熒光定量PCR儀購(gòu)于Life technologies公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇凈安泰有限公司。microRNA-21的序列為：正義:5′-TGGGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′;反義:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′。內(nèi)參基因U6序列：正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；反義:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。本研究采用2-△Ct代表microRNA-21的相對(duì)表達(dá)量，△Ct=(目標(biāo)microRNACt值-U6Ct值)。

1.5生物信息學(xué)分析 采用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性進(jìn)行分析；microRNA-21的靶基因預(yù)測(cè)采用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)及CoMeTa數(shù)據(jù)分別進(jìn)行預(yù)測(cè)，取同時(shí)出現(xiàn)于二者的靶基因作為microRNA-21的潛在靶基因；采用DAVID基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-21靶基因的功能和信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血清microRNA-21的表達(dá) 試驗(yàn)組外周血清microRNA-21的相對(duì)表達(dá)量(2.53±0.95)高于對(duì)照組(1.05±0.64)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性 在UCSC基因組在線數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redi-rect=manual &source=genome.ucsc.edu)進(jìn)行如下設(shè)置：Popular Species選擇為Human，Human Assembly選擇為Dec.2013(GRCh38/hg38)，在Position中輸入hsa-miR-21，結(jié)果顯示，microRNA-21在人類基因組中位于染色體17q23.1上的59841266-59841337位點(diǎn)上，長(zhǎng)度為72 bp；而保守性分析結(jié)果顯示microRNA-21基因序列在人、小鼠、大象、雞、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑馬魚、七鰓鰻9個(gè)物種之間高度保守。見圖1。

圖1 microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性分析

2.3microRNA-21可能靶基因預(yù)測(cè) 在Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.target-scan.org/)中將Select a species設(shè)置為Human，在Enter a micro-RNA name中輸入miR-21-5p，結(jié)果顯示共有320個(gè)可能靶基因；而在CoMeTa數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cometa.tigem.it/index.php)首頁(yè)中選擇miRNA target predictions(CoMeTa targets link)項(xiàng)，再在Type your Input中輸入hsa-miR-21-5P，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)791個(gè)可能靶基因。

2.4通過繪制Venn圖預(yù)測(cè)microRNA-21潛在靶基因 通過網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)和CoMeTa數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)出現(xiàn)的靶基因的Venn圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有146個(gè)潛在靶基因。見表1、圖2。

表1 microRNA-21靶基因

續(xù)表1 microRNA-21靶基因

圖2 microRNA-21潛在靶基因Venn圖

2.5microRNA-21靶基因功能富集(GO)分析和KEGG Pathway分析 通過DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Venn圖求得的146個(gè)交集靶基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-21的靶基因主要富集于RNA合成代謝、細(xì)胞增殖凋亡、轉(zhuǎn)錄、磷代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過程中。而對(duì)KEGG Pathway進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-21靶基因主要富集于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β信號(hào)通路中。其中MAPK是常見的腫瘤信號(hào)通路，以JAK-STAT信號(hào)通路中的靶基因分布示意圖見圖3～5。

圖3 microRNA-21靶基因KEGG Pathway分析結(jié)果

圖4 microRNA-21靶基因部分GO分析結(jié)果

圖5 microRNA-21靶基因在MAPK信號(hào)通路中分布

3 討 論

由于中樞神經(jīng)存在血腦屏障的保護(hù)，既往普遍認(rèn)為對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷或預(yù)測(cè)采用循環(huán)血標(biāo)志物意義不大。然而，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可造成血腦屏障結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生破壞，使得腦脊液中的部分物質(zhì)可穿過血腦屏障進(jìn)入外周循環(huán)血中，因此，這些分子在一定程度上具有預(yù)測(cè)或診斷某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用，如腦梗死、腦出血等〔8〕。microRNA是一類小分子物質(zhì)，表達(dá)穩(wěn)定，可在外周循環(huán)血中被穩(wěn)定檢測(cè)。近年研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化等作用，然而關(guān)于microRNA-21在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中的表達(dá)情況及microRNA-21調(diào)控膠質(zhì)瘤可能的分子網(wǎng)絡(luò)尚不明確〔5〕。本研究利用USUC數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)microRNA-21定位于人染色體12q23.1上，在人、小鼠、大象、雞、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑馬魚、七鰓鰻9個(gè)物種之間核苷酸序列高度保守，而RT-PCR結(jié)果顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中microRNA-21高表達(dá)，可能原因?yàn)橛捎谀[瘤的侵襲、生長(zhǎng)等可在一定程度上導(dǎo)致血腦屏障的破壞，腫瘤組織中產(chǎn)生的microRNA-21可穿過血腦屏障進(jìn)入外周循環(huán)血液中，提示microRNA-21參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病。microRNA發(fā)揮生物學(xué)功能是通過與特定靶基因的mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而抑制相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯或直接降解相關(guān)mRNA的作用。為進(jìn)一步探討microRNA-21在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病中可能的分子網(wǎng)絡(luò)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-21靶基因包括BCL2、SOCS3、MEF2C、PP3CA等146個(gè)。于士柱等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)BCL2抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖引起腫瘤體積增大；Lei等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)SOCS3啟動(dòng)子序列中的甲基化程度的高低與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)有明顯關(guān)系；MEF2C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，能提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞抵抗缺氧、氧化刺激及增加腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的能力。研究顯示性別決定SOX2在正常腦組織中不表達(dá)，而在幾乎所有的腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，有研究證實(shí)SOX2是癌癥神經(jīng)干細(xì)胞維持自我更新的關(guān)鍵因子，其可能是治療惡性膠質(zhì)瘤的潛在靶點(diǎn)〔11～14〕。

采用生物學(xué)信息的方法不僅能快速預(yù)測(cè)microRNA-21靶基因，還能對(duì)相關(guān)靶基因主要功能及參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析。有研究報(bào)道MAPK信號(hào)通路異常與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)，Antonyak等〔15,16〕研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子P-JNK在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，李靜等〔17〕研究顯示STAT3信號(hào)途徑是治愈腦膠質(zhì)瘤的潛在靶標(biāo)，另有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路在腦膠質(zhì)瘤中高度激活且其激活程度與患者預(yù)后關(guān)系密切〔18,19〕。

本研究通過RT-PCR及生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)microRNA-21在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中高表達(dá)，且可通過調(diào)控多個(gè)靶基因參與多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)進(jìn)而參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA表達(dá)譜及其調(diào)控機(jī)制添加了新的證據(jù)，同時(shí)也為今后的研究提供了方向。