于志紅 張娟 劉培民

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

胃癌屬于臨床常見惡性腫瘤且嚴(yán)重威脅人類生命安全，胃癌轉(zhuǎn)移是胃癌患者治療效果不佳及不良預(yù)后的重要原因〔1〕。研究表明上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可參與多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程，其主要特點(diǎn)為上皮標(biāo)志蛋白上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)與波形蛋白(Vimentin)表達(dá)升高，提示EMT途徑活化可能促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程〔2〕。沉默小核仁RNA宿主基因(SNHG)6表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，既往研究表明抑癌基因過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制EMT進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔3，4〕。因而如何抑制EMT過(guò)程是抑制胃癌轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。微小RNA(miR)-107在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制miR-107表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，但關(guān)于其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明〔5〕。原鈣黏蛋白(PCDH)17是腫瘤抑制因子，研究顯示PCDH17可抑制鼻咽癌發(fā)生及發(fā)展〔6〕。PCDH-17可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔7〕。通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)miR-107的靶基因，發(fā)現(xiàn)PCDH17的3′UTR上存在miR-107靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示PCDH17可能是miR-107的靶基因，因此，本研究主要探討miR-107是否可通過(guò)調(diào)控靶基因PCDH17表達(dá)而調(diào)節(jié)EMT途徑進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞遷移、侵襲，為揭示胃癌轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2017年8月至2019年3月河南省中醫(yī)院院收治的胃癌患者90例為研究對(duì)象，患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為胃癌，均接受手術(shù)治療，其中男50例，女40例，年齡為50～70歲，平均年齡為(63.25±7.30)歲，患者術(shù)前均未接受放療或化療，根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期20例、Ⅱ期30例、Ⅲ期35例、Ⅳ期5例；分化程度：低分化35例，中分化25例，高分化30例。術(shù)中切取胃癌組織及癌旁組織，放入液氮中保存。

1.2材料與試劑 胃癌MKN-28細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCDH17、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；miR-107模擬物(mimics)及陰性對(duì)照、miR-107抑制物(anti-miR-107)及陰性對(duì)照、siRNA-PCDH17及其陰性對(duì)照均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自上海吉瑪基因有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 胃癌MKN-28細(xì)胞培養(yǎng)條件：含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)將胃癌MKN-28細(xì)胞隨機(jī)分為pcDNA-con組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)、pcDNA-PCDH17組(轉(zhuǎn)染PCDH17過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)、si-con組(轉(zhuǎn)染PCDH17陰性對(duì)照)、si-PCDH17組(轉(zhuǎn)染siRNA-PCDH17)、pcDNA-PCDH17+miR-con組(共轉(zhuǎn)染PCDH17過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與miR-con)、pcDNA-PCDH17+miR-107組(共轉(zhuǎn)染PCDH17過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與miR-107 mimics)。轉(zhuǎn)染前更換為不含胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后6 h更換完全DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-107、PCDH17 mRNA表達(dá)水平 取胃癌組織及癌旁組織，加入1 ml Trizol試劑提取組織總RNA，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MKN-28細(xì)胞，加入700 μl裂解液提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度與純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR：預(yù)變性95℃ 5 min循環(huán)1次，(變性)95℃ 15 s，(退火)60℃ 20 s，(延伸)72℃ 10 s(共重復(fù)40次循環(huán))。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后觀察熒光反應(yīng)曲線及擴(kuò)增效率、循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-107、PCDH17 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MKN-28細(xì)胞，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，Transwell小室(孔徑8 μm)的上室加入100 μl細(xì)胞懸液，另取600 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄Transwell小室上室內(nèi)液體，使用無(wú)水甲醇固定30 min，用棉簽擦去Transwell小室上室為過(guò)膜的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，置于倒置顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠(稀釋比1∶3)，取40 μl稀釋基質(zhì)膠平鋪于Transwell小室(孔徑8 μm)底部的上室面，放入37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30 min，其余實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.4熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-107靶基因 用TargetScan預(yù)測(cè)miR-107的靶基因，發(fā)現(xiàn)PCDH17的3′UTR上存在miR-107靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示PCDH17可能是miR-107的靶基因，將PCDH17的3′UTR克隆并連接到報(bào)告基因載體(WT-PCDH17)，同時(shí)將含3′UTR結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變的序列連接到報(bào)告基因載體(MUT-PCDH17)。同時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MKN-28細(xì)胞，按照每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板，放入37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，WT-PCDH17與miR-107 mimics共同轉(zhuǎn)染至MKN-28細(xì)胞，記為(3′UTR-WT)miR-107組，以共轉(zhuǎn)染miR-con為對(duì)照，記為(3′UTR-WT)miR-con組；將miR-107 mimics與MUT-PCDH17共轉(zhuǎn)染至MKN-28細(xì)胞，記為(3′UTR-MUT)miR-107組，以共轉(zhuǎn)染miR-con為對(duì)照，記為(3′UTR-MUT)miR-con組，轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-107與PCDH17的靶向調(diào)控關(guān)系，分別將miR-107 mimics、anti-miR-107轉(zhuǎn)染至MKN-28細(xì)胞，以陰性轉(zhuǎn)染為對(duì)照，分別記為miR-107組、miR-con組、anti-miR-107組、anti-miR-con組，采用Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中PCDH17蛋白表達(dá)。

1.3.5Western印跡檢測(cè)PCDH17、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá) 取各組MKN-28細(xì)胞，加入蛋白裂解液〔1 ml RIPA、1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕，冰上裂解30 min提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入加樣緩沖液促使蛋白變性，取30 μg蛋白樣本上樣，預(yù)先制備10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(稀釋比1∶5 000)，室溫孵育2 h，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液，采用Quantityone軟件檢測(cè)條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織及癌旁組織中miR-107、PCDH17表達(dá)比較 與癌旁組織相比，胃癌組織中miR-107的表達(dá)水平顯著升高(1.01±0.10 vs 3.59±0.30，P<0.05)，而PCDH17 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(1.02±0.11 vs 0.48±0.04，P<0.05)。

2.2PCDH17對(duì)MKN-28胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與pcDNA-con組相比，pcDNA-PCDH17組胃癌MKN-28細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)；與si-con組相比，si-PCDH17組胃癌MKN-28細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)，見圖1、表1。

2.3PCDH17對(duì)胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表達(dá)的影響 相對(duì)于pcDNA-con組，pcDNA-PCDH17組胃癌MKN-28細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與si-con組相比，si-PCDH17組胃癌MKN-28細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而N-Cadherin、Vimentin表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

1～4：pcDNA-con組、si-con組、pcDNA-PCDH17組、si-PCDH17組；圖2同

表1 PCDH17對(duì)MKN-28胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與pcDNA-con組比較:1)P<0.05；與si-con組比較:2)P<0.05；表2同

圖2 Western印跡檢測(cè)E細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表達(dá)的影響

表2 PCDH17對(duì)胃癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表達(dá)的影響

2.4miR-107靶向PCDH17 TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-107與PCDH17存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，WT-PCDH17、miR-107 mimics共轉(zhuǎn)染組與WT-PCDH17、miR-con共轉(zhuǎn)染組相比細(xì)胞熒光活性顯著降低(P<0.05)；而MUT-PCDH17、miR-107 mimics共轉(zhuǎn)染組與MUT-PCDH17、miR-con共轉(zhuǎn)染組相比細(xì)胞熒光活性變化不顯著(P>0.05)，見表3。表明miR-107可靶向結(jié)合PCDH17并負(fù)向調(diào)控其活性。進(jìn)一步研究顯示，miR-107組胃癌MKN-28細(xì)胞PCDH17蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-con組(0.15±0.03 vs 0.40±0.05，P<0.05)，anti-miR-107組胃癌MKN-28細(xì)胞PCDH17蛋白表達(dá)水平顯著高于anti-miR-con組(1.05±0.10 vs 0.35±0.05，P<0.05)，見圖4。

圖3 TargetScan對(duì)miR-107和PCDH17結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)

表3 miR-con或miR-107與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MKN-28細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

2.5高表達(dá)miR-107可以部分逆轉(zhuǎn)PCDH17高表達(dá)對(duì)MKN-28遷移和侵襲的影響 與pcDNA-PCDH17+miR-con組相比，pcDNA-PCDH17+miR-107組胃癌MKN-28細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)，N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與pcDNA-con組比較，pcDNA-pcDH17組胃癌MKN-28細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖5、表5。

1～4：miR-con組、miR-107組、anti-miR-con組、anti-miR-107組

1～4：pcDNA-con組、pcDNA-PCDH17組、pcDNA-PCDH17+miR-con組、pcDNA-PCDH17+miR-107組

表5 高表達(dá)miR-107可以部分逆轉(zhuǎn)PCDH17高表達(dá)對(duì)MKN-28遷移和侵襲的影響

與pcDNA-con組比較：1)P<0.05；與pcDNA-PCDH17+miR-con組比較：2)P<0.05

3 討 論

胃癌死亡率逐年增加，目前臨床主要采用手術(shù)、化療或放療等方式治療胃癌，但患者總體生存期仍未明顯延長(zhǎng)〔8〕。EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移、傷口愈合呈多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究表明EMT可在膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔9，10〕。但誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)制仍未完全闡明。

miR-107在人子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-107表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔11〕。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中miR-107上調(diào)表達(dá)，下調(diào)miR-107表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖〔12〕。miR-107通過(guò)靶向調(diào)控前列腺細(xì)胞凋亡反應(yīng)(Par)4而促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡〔13〕。但相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)miR-107通過(guò)靶向PI3K/AKT途徑而抑制胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移〔14〕。本研究結(jié)果顯示胃癌組織及細(xì)胞系中miR-107的表達(dá)量明顯升高，這可能是由于miR-107可調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)進(jìn)而參與胃癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，靶基因在腫瘤中的表達(dá)及其作用機(jī)制不同導(dǎo)致miR-107在胃癌中發(fā)揮作用不同，因此本研究從多角度分析miR-107在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)顯示PCDH17可能是miR-107的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-107可靶向調(diào)控PCDH17，并可負(fù)向調(diào)控PCDH17表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PCDH17在胃癌組織中表達(dá)降低，提示miR-107可能通過(guò)抑制靶基因PCDH17表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌發(fā)生及發(fā)展。

前列腺癌患者血清中PCDH17表達(dá)降低，其可作為前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子〔15〕。PCDH17甲基化導(dǎo)致其表達(dá)水平降低進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌、卵巢癌、喉鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔16～18〕。本研究通過(guò)上調(diào)PCDH17表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯降低，下調(diào)PCDH17表達(dá)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PCDH17過(guò)表達(dá)可促進(jìn)E-Cadherin表達(dá)，而抑制N-Cadherin、Vimentin表達(dá)，下調(diào)PCDH17表達(dá)可抑制E-Cadherin表達(dá)，而促進(jìn)N-Cadherin、Vimentin表達(dá)，研究報(bào)道指出上調(diào)LIM結(jié)構(gòu)域(LMO)1表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲，EMT主要指機(jī)體內(nèi)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞而增強(qiáng)細(xì)胞遷移及侵襲能力〔19，20〕。本研究結(jié)果證實(shí)PCDH17在EMT信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-107表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PCDH17高表達(dá)對(duì)MKN-28遷移、侵襲的抑制作用，并可抑制E-Cadherin表達(dá)，而促進(jìn)N-Cadherin、Vimentin表達(dá)，提示miR-107表達(dá)水平升高可通過(guò)抑制靶基因PCDH17表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲，其可能通過(guò)促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化進(jìn)程而發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-107表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其可能通過(guò)抑制靶基因PCDH17表達(dá)促使EMT轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)目的，為揭示miR-107在胃癌致病機(jī)制中的研究提供新思路。但關(guān)于miR-107在胃癌發(fā)生及發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，后續(xù)研究將進(jìn)一步探索miR-107在胃癌致病機(jī)制中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為胃癌靶向治療提供潛在靶點(diǎn)。