劉 玲， 楊俊文， 陳 成， 戴慧芳， 許婷婷， 孟 壯， 方炎明

(1. 淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院， 安徽 淮南 232038； 2. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 江蘇 南京 210037)

碳納米管(CNTs)是一種纖維化的納米材料，因其具有自收縮、抗裂、增韌和半導(dǎo)體等特性被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、陶瓷業(yè)和信息工程等領(lǐng)域[1-3]。由于對(duì)CNTs持續(xù)的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用，CNTs不可避免地釋放到環(huán)境中[4-5]。植物是生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，在從土壤或水體吸收營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)伴隨著對(duì)其中CNTs的吸附，植物對(duì)CNTs具有潛在的累積效應(yīng)，被認(rèn)為是CNTs進(jìn)入生物循環(huán)的重要途徑[6-7]。因此，研究CNTs對(duì)植物生長(zhǎng)的毒性效應(yīng)及其在環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。CNTs分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)，其中，MWCNTs具有較強(qiáng)的抗壓抗折[8-9]和導(dǎo)電導(dǎo)熱能力[10-11]，且成本較低，易制取，用途廣泛[12]。MWCNTs的表面功能化能改變材料本身的化學(xué)和物理學(xué)特性，使其穩(wěn)定性和生物相容性增加，從而增強(qiáng)材料本身的工業(yè)化應(yīng)用潛力[13]。羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)作為MWCNTs表面功能化的典型代表，其分散性和親水性更佳，市場(chǎng)應(yīng)用前景更廣。

近年來(lái)，MWCNTs和MWCNTs-COOH的生態(tài)安全性受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。研究結(jié)果表明：MWCNTs可降低微生物活力[14]，引起小鼠骨髓細(xì)胞和人體淋巴細(xì)胞染色體畸變和DNA異常，影響肝臟代謝功能，對(duì)哺乳動(dòng)物具有潛在毒性[15-17]。高濃度MWCNTs不僅抑制藻細(xì)胞增殖，降低葉綠素a含量和抗氧化酶活性[18-19]，還對(duì)作物根和葉的形態(tài)產(chǎn)生不利影響[20]。另外，MWCNTs團(tuán)聚物對(duì)植物細(xì)胞也存在脅迫，干擾擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕T87懸浮細(xì)胞的干質(zhì)量、通透性和超氧化物歧化酶(SOD)活性等[21]。MWCNTs-COOH進(jìn)入植物體內(nèi)，致使葉片氧化損傷加劇，植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞[22]。

MWCNTs-COOH具有較大的比表面積且易分散在水體中，其吸附性能得到極大發(fā)揮，易成為有機(jī)和重金屬污染物的載體，并對(duì)其毒性產(chǎn)生影響[23-24]。已有研究結(jié)果證明：MWCNTs-COOH具有吸附重金屬的能力，并能夠促進(jìn)重金屬離子向植物根和葉細(xì)胞內(nèi)部滲透[22]。在MWCNTs-COOH和重金屬?gòu)?fù)合污染的環(huán)境介質(zhì)中，二者間不可避免地會(huì)發(fā)生相互作用，進(jìn)而干擾重金屬的環(huán)境行為和對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)[25]。目前，關(guān)于單一MWCNTs-COOH或鎘(Cd)對(duì)植物生長(zhǎng)影響的研究很多，而關(guān)于MWCNTs-COOH與Cd復(fù)合作用下對(duì)植物生長(zhǎng)影響的研究較少，MWCNTs-COOH與Cd復(fù)合作用對(duì)植物的毒性作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究以水稻(OryzasativaLinn.)品種‘Y兩優(yōu)900’(‘Y Liangyou 900’)幼苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取Cd作為典型重金屬，研究水稻幼苗在MWCNTs-COOH單一及其與Cd復(fù)合處理下葉片生理特性的變化，以期為早期診斷和科學(xué)評(píng)價(jià)MWCNTs-COOH與Cd復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)及鎘(Cd)的母液配制 MWCNTs-COOH(外徑8～15 nm，長(zhǎng)0.5～2.0 μm，純度大于95%)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司。取500 mg MWCNTs-COOH，加入適量的去離子水，使用SCIENTZ JY92-Ⅱ超聲波破碎儀(河北慧采科技開(kāi)發(fā)有限公司)于650 W超聲振蕩150次，每次振蕩15 s、間歇10 s，最后定容至500 mL，制成1 mg·mL-1MWCNTs-COOH母液，備用，使用時(shí)進(jìn)行稀釋。

供試Cd源為氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)。取1.140 g氯化鎘，加入適量去離子水溶解，然后定容至500 mL，制成10 μmol·mL-1Cd母液，備用，使用時(shí)進(jìn)行稀釋。

1.1.2 水稻幼苗培養(yǎng) 將籽粒飽滿、大小基本一致的水稻品種‘Y兩優(yōu)900’種子(湖南袁創(chuàng)超級(jí)稻技術(shù)有限公司)進(jìn)行浸種催芽(0.1 mol·L-1HNO3溶液浸泡16～24 h，去離子水清洗后，于30 ℃水浴中浸泡2 d，每天換水2次)，種子露白后，放在鋪有濕潤(rùn)紗布的白瓷盤(pán)中，于黑暗條件、30 ℃人工氣候箱中培育。待幼芽長(zhǎng)至約5 mm時(shí)，挑選芽勢(shì)相近的萌發(fā)種子懸浮培養(yǎng)于1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中(漂浮板固定)，于光照度3 000 lx、光照時(shí)間16 h·d-1和空氣相對(duì)濕度70%條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。待第3枚真葉長(zhǎng)出，株高和直徑分別達(dá)7.5 cm和0.5 cm 左右(種子萌發(fā)21 d)，移植到培養(yǎng)盒(長(zhǎng)320 mm、寬240 mm、高120 mm)中進(jìn)行處理，每盒48株幼苗。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 設(shè)置MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理，共10個(gè)處理：CK1不添加MWCNTs-COOH，即0 mg·L-1MWCNTs-COOH；S1、S2、S3和S4單一處理分別添加1.5、3、6和12 mg·L-1MWCNTs-COOH；CK2添加10 μmol·L-1Cd；C1、C2、C3和C4復(fù)合處理分別添加1.5、3、6和12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，pH 5.3至pH 5.5。每7 d更換1次處理液。21 d后，測(cè)定和觀察葉片相關(guān)指標(biāo)。每個(gè)處理種植3個(gè)培養(yǎng)盒，即為3次重復(fù)。

SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[27]218-219并略有改動(dòng)。稱取葉片0.5 g，加入5倍于樣品質(zhì)量的50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.8)冰浴研磨，經(jīng)10 000 r·min-1離心20 min，上清液為粗酶提取液。取粗酶提取液0.1 mL，加入50 mmol·L-1磷酸緩沖液3.5 mL、130 mmol·L-1混合型甲硫氨酸0.5 mL、750 μmol·L-1NBT 0.5 mL、100 μmol·L-1EDTA-Na20.5 mL、蒸餾水0.4 mL和20 μmol·L-1核黃素0.5 mL(最后加入)，在光照度2 000 lx條件下照射12 min后立即測(cè)定OD560，計(jì)算SOD活性。

各處理每個(gè)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 葉片H2O2定位 葉片H2O2定位參考王晨芳[28]的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色法并略有改動(dòng)。于每個(gè)培養(yǎng)盒中隨機(jī)選取3株水稻幼苗的倒三葉置于錐形瓶中，加1 mg·mL-1DAB染液浸沒(méi)，于黑暗條件、120 r·min-1搖床振蕩過(guò)夜后，光照度2 000 lx下照射至所有葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)。然后將水稻葉片從DAB染液中取出，加脫色液〔V(無(wú)水乙醇)∶V(甘油)∶V(去離子水)=15∶1∶4〕后，于80 ℃水浴脫色30 min，將脫色的葉片抽真空后平鋪于濾紙上，對(duì)比不同處理和對(duì)照間各葉片顏色的差異并拍照。每處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，利用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理對(duì)水稻幼苗葉片生理指標(biāo)的影響

MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理對(duì)水稻幼苗葉片生理指標(biāo)的影響見(jiàn)表1。

2.1.1 對(duì)葉綠素含量的影響 由表1可見(jiàn)：隨著MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片葉綠素含量呈逐漸降低的趨勢(shì)，但與0 mg·L-1MWCNTs-COOH(CK1)組間均無(wú)顯著差異；MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組水稻幼苗葉片葉綠素含量的變化趨勢(shì)與MWCNTs-COOH單一處理組相同，其中，1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C1)和3 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C2)復(fù)合處理組的葉綠素含量均高于0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(CK2)組，12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C4)復(fù)合處理組的葉綠素含量較CK2組顯著(P<0.05)降低。同一質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組的葉綠素含量均低于MWCNTs-COOH單一處理組，其中，C4復(fù)合處理組與12 mg·L-1MWCNTs-COOH(S4)單一處理組間差異顯著。

2.1.2 對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響 由表1還可見(jiàn)：隨著MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，4個(gè)MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片SOD活性均高于CK1組，其中，6 mg·L-1MWCNTs-COOH(S3)單一處理組的SOD活性(24.70 U·mg-1)最高；MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組水稻幼苗葉片SOD活性呈逐漸降低的趨勢(shì)，其中，C1復(fù)合處理組的SOD活性(21.59 U·mg-1)最高。同一質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組的SOD活性均低于MWCNTs-COOH單一處理組，其中，C2、6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C3)和C4復(fù)合處理組分別與對(duì)應(yīng)的單一處理組間差異顯著。

2.1.3 對(duì)過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響 由表1還可見(jiàn)：隨著MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片POD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中，3 mg·L-1MWCNTs-COOH(S2)和S3單一處理組的POD活性較高，與CK1組間差異顯著，之后POD活性顯著降低；MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組水稻幼苗葉片POD活性呈“降低—顯著升高—降低”的趨勢(shì)。同一質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組與MWCNTs-COOH單一處理組間水稻幼苗葉片POD活性均存在顯著差異。

2.1.4 對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響 由表1還可見(jiàn)：隨著MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度提高，MWCNTs-COOH單一處理組水稻幼苗葉片MDA含量呈逐漸升高的趨勢(shì)，其中，S3和S4單一處理組的MDA含量較高，分別較CK1組顯著升高了17.1%和23.4%；MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組水稻幼苗葉片MDA含量的變化趨勢(shì)與MWCNTs-COOH單一處理組相同，但不同質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組間的MDA含量無(wú)顯著差異。同一質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理組的MDA含量均高于MWCNTs-COOH單一處理組，但均無(wú)顯著差異。

2.2 MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理對(duì)水稻幼苗葉片H2O2定位的影響

MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理對(duì)水稻幼苗葉片H2O2定位的影響見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)：1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH單一處理組與1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd復(fù)合處理組間水稻幼苗葉片褐色斑點(diǎn)面積差異不大；與0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd組相比，6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd和12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd復(fù)合處理組葉片褐色斑點(diǎn)面積增大、顏色加深。

CK1： 0 mg·L-1MWCNTs-COOH； S1： 1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH； S2： 3 mg·L-1MWCNTs-COOH； S3： 6 mg·L-1MWCNTs-COOH； S4： 12 mg·L-1MWCNTs-COOH； CK2： 0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C1： 1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C2： 3 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C3： 6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C4： 12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd.

圖1 MWCNTs-COOH單一及MWCNTs-COOH-Cd復(fù)合處理對(duì)水稻幼苗葉片H2O2定位的影響

Fig. 1 Effect of single MWCNTs-COOH and combined MWCNTs-COOH-Cd treatments on H2O2localization of leaves ofOryzasativaLinn. seedlings

3 討 論

葉綠素含量是反映植物光合作用水平的基本指標(biāo)[29]。楊祥宇[30]的研究結(jié)果表明：1～50 mg·L-1納米二氧化鈦能夠提高黃瓜(CucumissativusLinn.)和蘆葦〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕等植物的光合色素含量。本研究中，1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH(S1)單一處理組水稻幼苗葉片葉綠素含量最高，而12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C4)復(fù)合處理組的葉綠素含量最低，說(shuō)明低質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH可能對(duì)水稻生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，高質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH和重金屬Cd共同作用則會(huì)對(duì)水稻造成毒害作用，使葉綠素合成受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致葉綠素含量下降。MWCNTs-COOH單一及其與Cd復(fù)合處理均較納米二氧化鈦對(duì)植物的毒性更強(qiáng)，這可能與納米材料和植物種類有關(guān)[31]，但具體原因還有待深入研究。

綜上所述，高質(zhì)量濃度MWCNTs-COOH單一及其與Cd復(fù)合處理對(duì)水稻幼苗葉片生理和生長(zhǎng)影響顯著，主要表現(xiàn)為SOD和POD活性降低、MDA含量升高、葉綠素降解及葉片受損傷等，因此，要降低MWCNTs-COOH與Cd復(fù)合作用帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。