李陽(yáng) 張麗珍 楊埔 張一中

摘要：從正常發(fā)酵的生料醋醅中分離、篩選得到一株醋酸菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、16S rDNA基因序列分析，確定菌株為巴氏醋桿菌。菌株發(fā)酵過(guò)程中，改變發(fā)酵溫度和初始乙醇添加量，研究其對(duì)有機(jī)酸種類和含量的影響，為評(píng)價(jià)食醋品質(zhì)提供參考依據(jù)。利用高效液相色譜檢測(cè)樣品，檢測(cè)到的有機(jī)酸有草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，最高含量分別是2.5 mg/100 mL，5.0 mg/mL，3.4 mg/100 mL，0.17 mg/mL。在37，42，47 ℃這3個(gè)溫度下最適宜有機(jī)酸生成的乙醇添加量分別是4%，6%，2%，最利于醋酸菌發(fā)酵的溫度是42 ℃。

關(guān)鍵詞：生料醋醅;醋酸菌;溫度;乙醇含量;有機(jī)酸

中圖分類號(hào)：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.002

Effect of Different Temperature and Ethanol Content on Acid Production Ability of Acetic Acid Bacteria in Raw Material Vinegar

LI Yang1，*ZHANG Lizhen1，YANG Pu1，ZHANG Yizhong2

（1. School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan，Shanxi 030006，China;

2. Institute of Sorghum Research，Shanxi Academy of Agriculture Sciences，Jinzhong，Shanxi 030600，China）

Abstract：A strain of Acetobacter was isolated and screened from the normal fermented raw material vinegar，and the strain was identified as Acetobacter pasteurianus by morphological and 16S rDNA gene sequence analysis. During the fermentation of the strain，the fermentation temperature and initial ethanol addition were adjusted to studied its effect on the type and content of organic acid，which provided a reference for evaluating the quality of vinegar. The samples were detected by high performance liquid chromatography. The organic acids detected were oxalic acid，lactic acid，acetic acid and citric acid，and the highest content were 2.5 mg/100 mL，5.0 mg/mL，3.4 mg/100 mL，and 0.17 mg/mL respectively. The optimum ethanol content at different temperatures 37，42，47 ℃ was 4%，6%，2%. The optimum fermentation temperature for acetic acid bacteria was 42 ℃.

Key words：raw vinegar;acetic acid bacteria;temperature;ethanol addition;organic acid

食醋在春秋時(shí)期就有記載，是一種常見(jiàn)的酸味調(diào)味料，通常以糧食為主料，加入大曲后進(jìn)行糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵[1]，再加水淋制最終得到成品醋的過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程中微生物種類眾多、成分豐富，含有多種維生素、氨基酸[2]，還有黃酮、酚酸[3]等有益成分，在降低血壓[4]、緩解疲勞[5]等方面有顯著效果，因此人們對(duì)食醋的需求也越來(lái)越高。傳統(tǒng)食醋的釀造原料需要經(jīng)過(guò)蒸煮，生料醋的特色就是原料與發(fā)酵劑混合后直接發(fā)酵[6]，釀造過(guò)程中反應(yīng)類型更多、更復(fù)雜[7]，因此口感與傳統(tǒng)食醋相比更加醇厚。

醋酸菌在釀造過(guò)程中扮演重要角色，負(fù)責(zé)將乙醇氧化成乙酸[8-9]，過(guò)高的乙醇含量會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)[10]，不適的溫度會(huì)破壞發(fā)酵酶類的活性[11]，因此探究合適的初始乙醇含量和發(fā)酵溫度尤為重要。關(guān)于生料醋醅中醋酸菌的研究相對(duì)較少，可以參考的數(shù)據(jù)不多。陳洋[12]從浙江等醋廠中篩選出了耐10%乙醇、耐40 ℃高溫的醋酸桿菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為巴氏醋桿菌，并研究了其耐乙醇機(jī)制。胡宇豪等人[13]對(duì)耐12%乙醇的巴氏醋桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得出在常規(guī)培養(yǎng)基中加入5.5%乙醇、0.5%乙酸時(shí)，產(chǎn)酸量可以最大程度地提高。李文等人[14]從腐爛的獼猴桃中篩選出一株醋酸菌，耐40 ℃高溫、耐12%高醇，經(jīng)研究可使產(chǎn)酸量提高30.54%。向進(jìn)樂(lè)等人[15]從木瓜醋中檢測(cè)出了草酸、酒石酸等10種有機(jī)酸，且醋酸含量最高。目前，生料醋的研究尚存在較多空白，比如有機(jī)酸的類型、高溫、高醇對(duì)其發(fā)酵性能的影響等。

試驗(yàn)以自然發(fā)酵的生料醋醅為樣品，分離純化出醋酸菌菌種，再通過(guò)菌落形態(tài)特征、產(chǎn)酸定性試驗(yàn)、16S rDNA序列的分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。發(fā)酵過(guò)程中添加不同含量的乙醇，研究不同溫度下對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸特性的影響，研究成果可以作為優(yōu)化醋酸發(fā)酵的數(shù)據(jù)參考。

1?? 材料與方法

1.1?? 材料與試劑

1.1.1?? 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨4 g/L，瓊脂12 g/L，1.6%溴甲酚紫4 000 μL，滅菌后加入3%無(wú)水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，瓊脂12 g/L，接種前加入5%無(wú)水乙醇。

1.1.2?? 試劑

無(wú)水葡萄糖，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司提供;硫酸鎂，天津市北辰方正試劑廠提供;磷酸二氫鉀，北京精求化工廠提供;酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;無(wú)水乙醇，天津歐博凱化工有限公司提供;瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司提供;甲醇（色譜純）、甘油，北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供。

1.2?? 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，安捷倫科技公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰AIRTECH產(chǎn)品;AD-88型大容量全溫氣浴振蕩器，常州國(guó)宇儀器制造有限公司產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;MS7-H550-Pro型磁力攪拌器，SCILOGEX產(chǎn)品。

1.3?? 方法

1.3.1?? 醋酸菌的篩選

從發(fā)酵了12，18，24，30，36 d的醋醅中采樣約10 g，再分別加入裝有50 mL蒸餾水的錐形瓶中，于28 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，將樣品稀釋至10-3，吸取50 μL涂布至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，菌落長(zhǎng)出后，多次分離純化，直至長(zhǎng)出單一菌落，最后挑取菌落加入到甘油培養(yǎng)基中，于-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2?? 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)

挑取菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基活化2次，接入到加有溴甲酚紫酸堿指示劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，可使培養(yǎng)基變成黃色的菌株為產(chǎn)酸細(xì)菌。

1.3.3?? 菌種鑒定

篩選出菌種后編號(hào)為1，觀察其形態(tài)特征并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定其分類地位。

1.3.4?? 醋酸菌的產(chǎn)酸特性試驗(yàn)

醋酸菌涂布發(fā)酵培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱活化2～ 3 d，挑取已活化的菌株接種到試管發(fā)酵培養(yǎng)液，于振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，吸取2%的發(fā)酵培養(yǎng)液至錐形瓶培養(yǎng)48 h，從0 h開始，每隔12 h采一次樣。乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置6個(gè)梯度，分別是0，2%，4%，6%，8%，10%;培養(yǎng)溫度分別為37，42，47 ℃，通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定產(chǎn)酸類型和產(chǎn)酸量。

1.3.5?? 高效液相色譜條件

產(chǎn)酸高效液相色譜檢測(cè)條件參照楊鈺昆等人[16]的測(cè)定方法。色譜柱為AQ-C18;流動(dòng)相為甲醇∶磷酸二氫鉀（0.02 mol/L）為3∶97（V/V），磷酸調(diào)pH值至2.7，流速1.00 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.6?? 數(shù)據(jù)處理

將通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)利用SPSS 20軟件分析和Excel軟件繪制圖表。

2?? 結(jié)果與分析

2.1?? 醋酸菌的鑒定

2.1.1?? 醋酸菌的分離

菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。

該菌長(zhǎng)勢(shì)良好，菌落為白色小圓形，表面光滑，邊緣整齊。

2.1.2?? 醋酸菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定。挑取醋酸菌滴至有無(wú)菌水的載玻片上，干燥后用草酸銨結(jié)晶紫染液染色60 s，純凈水沖去多余染液，干燥后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。菌體呈短棒狀，單個(gè)或多個(gè)排列。

顯微鏡觀察圖見(jiàn)圖2。

（2）分子生物學(xué)鑒定。

醋酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖3。

2.2?? 37 ℃條件下發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化

2.2.1?? 乳酸含量變化

乳酸含量變化見(jiàn)圖4。

由圖4可知，不同乙醇含量的發(fā)酵液中，乳酸均呈增加趨勢(shì)。乳酸含量受乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較大，發(fā)酵48 h后，乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%和10%的培養(yǎng)液中乳酸含量最低，為2.6 mg/mL;添加量為2%時(shí)，乳酸含量達(dá)到最大，為4.7 mg/mL。

2.2.2?? 乙酸含量變化

乙酸含量變化見(jiàn)圖5。

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)乙酸含量由0增加到1.8 mg/100 mL;添加8%和10%乙醇時(shí)，發(fā)酵0 h檢測(cè)到乙酸含量為0.34 mg/100 mL和-0.36 mg/100 mL，可能是種子培養(yǎng)基代入，12 h后下降到0;添加0，4%，6%乙醇在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到乙酸。

2.2.3?? 檸檬酸含量的變化

檸檬酸含量變化見(jiàn)圖6。

由圖6可知，乙醇含量為4%時(shí)檸檬酸含量最高，發(fā)酵24 h含量最大，為0.08 mg/mL，高于添加量為8%的檸檬酸含量。不同的乙醇添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量的影響各不相同，其中添加量為10%時(shí)檸檬酸含量最低，可見(jiàn)高濃度乙醇含量不利于醋酸菌的發(fā)酵。

2.3?? 42 ℃條件下發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化

2.3.1?? 乳酸含量變化

乳酸含量變化見(jiàn)圖7。

由圖7可知，乙醇添加量越少，發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量增加越多，發(fā)酵48 h添加6%乙醇的培養(yǎng)液中，乳酸含量最高達(dá)到3.9 mg/mL;添加量為10%的乙醇在發(fā)酵至48 h時(shí)，乳酸含量最低，為3.1 mg/mL。

2.3.2?? 乙酸含量變化

乙酸含量變化見(jiàn)圖8。

由圖8可知，乙醇添加量為8%時(shí)，在48 h檢測(cè)到乙酸含量為3.4 mg/100 mL，高于37 ℃乙酸的最高含量;添加10%乙醇，發(fā)酵液中乙酸含量維持在2.5～3.4 mg/100 mL，高于添加6%乙醇檢測(cè)到的乙酸含量;添加0，2%，4%乙醇在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到乙酸。

2.3.3?? 檸檬酸含量變化

檸檬酸含量變化見(jiàn)圖9。

由圖9可知，乙醇添加量越少，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量的影響越低，發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸均呈增加的趨勢(shì)，添加量為4%的發(fā)酵液中檸檬酸含量最多，48 h達(dá)到0.17 mg/mL。

2.4?? 47 ℃條件下發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化

2.4.1?? 草酸含量變化

草酸含量變化見(jiàn)圖10。

由圖10可知，不添加乙醇的培養(yǎng)液中草酸含量最高，48 h含量達(dá)到2.5 mg/100 mL，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，添加2%乙醇的培養(yǎng)液中生成的草酸為1.7 mg/100 mL，均高于其他乙醇添加量;添加10%時(shí)草酸含量增加最低，發(fā)酵至48 h只有1.03 mg/100 mL。

2.4.2?? 乙酸含量變化

乙酸含量變化見(jiàn)圖11。

由圖11可知，除0外，不同乙醇添加量的發(fā)酵液中，乙酸含量都呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中添加2%的乙醇時(shí)乙酸含量最高，發(fā)酵48 h可達(dá)1.97 mg/100 mL;不添加乙醇的培養(yǎng)液中乙酸含量為0，可見(jiàn)乙醇可促進(jìn)乙酸的生成。

2.4.3?? 乳酸含量變化

乳酸含量變化見(jiàn)圖12。

由圖12可知，乳酸含量在發(fā)酵24 h內(nèi)都有不同程度的下降，24～48 h繼續(xù)增長(zhǎng)，可能是由于發(fā)酵初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗太快，乳酸作為碳源被利用。觀察不同乙醇含量對(duì)乳酸的影響，得出添加2%的乙醇，乳酸含量最高，發(fā)酵48 h達(dá)到5.02 mg/mL;添加4%乙醇乳酸含量最低，在48 h檢測(cè)只有3.19 mg/mL，低于42 ℃培養(yǎng)條件下檢測(cè)到的乳酸含量，可見(jiàn)溫度也是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。

3?? 結(jié)論

試驗(yàn)從生料醋醅中篩選出醋酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA鑒定為巴氏醋桿菌，通過(guò)改變其發(fā)酵過(guò)程中的溫度和乙醇添加量，研究其對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸特性的影響。

溫度設(shè)置37，42，47 ℃ 3個(gè)梯度，乙醇添加量設(shè)置0，2%，4%，6%，8%，10% 6個(gè)梯度。將2%的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵液后通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)樣品，檢測(cè)到的有機(jī)酸有草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，比趙方圓等人[17]的試驗(yàn)結(jié)果多一類草酸。不同溫度、乙醇含量對(duì)有機(jī)酸的生成影響較大，乙醇添加量為10%時(shí)有機(jī)酸的生成都受到了抑制，可見(jiàn)高濃度的乙醇會(huì)影響微生物的活性，與張?jiān)玛?yáng)等人[18]的研究結(jié)果一致。37，42，47 ℃ 3個(gè)溫度下最適宜有機(jī)酸生成的乙醇添加量分別是4%，6%，2%，耐受性低于孫文瑛等人[19]從腐爛水果中篩出的耐11%乙醇的醋酸菌。分析不同溫度下幾種有機(jī)酸的產(chǎn)酸量，可知42 ℃更適宜巴氏醋桿菌產(chǎn)酸，此菌株對(duì)溫度的耐受性高于邵建寧等人[20]研究的耐40 ℃高溫的醋酸菌。檢測(cè)到的有機(jī)酸中，乳酸含量最高為5.0 mg/mL，在42 ℃，8%乙醇條件下乙酸含量最高為4.2 mg/100 mL，二者在醋中均是含量最高的有機(jī)酸，與方冠宇等人[21]的研究結(jié)果一致。草酸、檸檬酸的含量最高時(shí)分別是2.5 mg/100 mL，0.17mg/mL，這類不揮發(fā)有機(jī)酸的存在很好地中和了乙酸帶來(lái)的刺激感，使醋的酸味更加柔和爽口。

通過(guò)對(duì)生料醋醅中的巴氏醋桿菌進(jìn)行研究，挑選出發(fā)酵的最適溫度和最適乙醇含量，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，最大程度增加生料醋中有機(jī)酸的含量，提升生料醋的口感，也為生料醋產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

參考文獻(xiàn)：

Wang Xiaodan，Shi Dong，Hu Bandong. Bacterial diversity of Moutai-flavour Daqu based on high-throuhgput sequencing method[J]. Journal of the Institute of Brewing，2017（1）：138-143.

王爭(zhēng)爭(zhēng)，張磊，李婷，等. 不同陳釀期山西老陳醋中氨基酸成分的變化研究[J]. 食品工程，2015（2）：52-54.

蘇靜. 山西老陳醋多酚類物質(zhì)的提取及抗氧化活性研究[D]. 太原：山西大學(xué)，2010.

劉珂. 淺談我國(guó)食醋的功能及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2010，35（6）：32-39.

信亞偉，孫惜時(shí)，談甜甜，等. 食醋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2015，40（2）：124-127.

陳洋，汪超，高冰，等. 高耐受性醋酸菌的篩選及發(fā)酵特性研究[J]. 中國(guó)釀造，2015，34（12）：28-33.

Wang X S，Du H，Zhang Y，et al. Environmental microbiota drives microbial succession and metabolic profiles during Chinese liquor fermentation[J]. Applenviron Microbiol，2018（4）：9-17.

王宗敏，陸震鳴，朱青，等. 鎮(zhèn)江香醋醋醅微生物Bacillus cirulans發(fā)酵特性的初步研究[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2016，41（9）：24-28.

B Ndoye，S Lebecque，R Dubois-Dauphin，et al. Themoresistant properties of acetic acids bacteria isolated from tropical products of Sub-Saharan Africa and destined to industrial vinegar[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，39（4）：916-923.

Wei Y Q，Wu X Y，Xu Z M，et al. A Thermotolerant Acetobacter pasteurianus T24 achieving acetic acid fermentation at high temperature in self-adaption experiment[J]. Advances in Applied Biotechnology，2015（4）：287-293.

Nittaya Pitiwittayakul，Pattaraporn Yukphan，Wilawan Sintuprapa，et al. Identification of acetic acid bacteria isolated in Thailand and assigned to the genus Acetobacter by GroEL gene sequence analysis[J]. Ann Microbiol，2015（3）：1 557-1 564.

陳洋. 耐乙醇醋酸菌特性研究及應(yīng)用[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2016.

胡宇豪，李戴陽(yáng)，汪超，等. 耐受乙醇巴氏醋桿菌ZJ-25培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 中國(guó)釀造，2017，36（4）：118-121.

李文，王陶，謝昊訊，等. 耐高溫、高醇醋酸菌篩選、鑒定及低能離子選育[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2018，18（8）：107-114.

向進(jìn)樂(lè)，羅磊，馬麗蘋，等. 木瓜酒和木瓜醋發(fā)酵工藝及其有機(jī)酸組成分析[J]. 食品科學(xué)，2016，37（23）：191-195.

楊鈺昆，宋佳，喬沈，等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定酵素原液中的乳酸和醋酸[J]. 食品工業(yè)科技，2018，39（10）：246-250.

趙方圓，李靜媛. 新型葡萄醋釀造工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（2）：124-128.

張?jiān)玛?yáng)，李海峰，曹健，等. 高耐受性醋酸菌的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造，2016，36（11）：11-14.

孫文瑛，陳雄，王志，等. 耐高溫高醇醋酸菌的篩選及其發(fā)酵工藝的初步優(yōu)化[J]. 中國(guó)釀造，2011（1）：44-47.

邵建寧，王秉峰，路等學(xué)，等. 耐高溫耐高酒度醋酸菌突變株的選育[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2005（9）：28-31.

方冠宇，穆曉靜，蔣矛箭，等. 浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化與有機(jī)酸形成相關(guān)性研究[J]. 食品科學(xué)，2019（11）：1-12.

收稿日期：2019-10-14

基金項(xiàng)目：山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201703D211010，201803D221008-9）。

作者簡(jiǎn)介：李陽(yáng)（1994—?? ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

*通訊作者：張麗珍（1977—?? ），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯镔Y源的篩選及利用。