黃煜 蔣家璇 張凱迪 姚沛琳

摘要：以羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力的測(cè)定、螯合亞鐵離子能力的測(cè)定為體外抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)，從皖北地區(qū)不同腌制菜中分離出20株乳酸菌，比較其菌體細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，不同乳酸菌的抗氧化能力存在差異，菌體細(xì)胞DPPH自由基清除率比無(wú)細(xì)胞提取物的強(qiáng)，而羥自由基清除能力和螯合亞鐵離子能力兩者相差不大，無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力相對(duì)于菌體的還原能力更強(qiáng)?？傮w上，菌株7-1的抗氧化能力較好。其中，菌株7-1，3-3，A-1的菌體細(xì)胞抗氧化能力強(qiáng)，菌株3-1，3-5，10-1的無(wú)細(xì)胞提取物抗氧化能力強(qiáng)。研究為后續(xù)乳酸菌抗氧化方面的應(yīng)用研究提供優(yōu)良的菌種資源。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;菌體細(xì)胞;無(wú)細(xì)胞提取物;抗氧化活性;篩選

中圖分類號(hào)：Q945???? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.005

Screening of High Antioxidant Lactic Acid Bacteria from Preserved Vegetables

in Northern Anhui Province

HUANG Yu，JIANG Jiaxuan，ZHANG Kaidi，YAO Peilin

（School of Biology and Food Engineering，Suzhou College，Suzhou，Anhui 234000，China）

Abstract：In this experiment，twenty strains of lactic acid bacteria were isolated from different preserved vegetables in northern anhui，provincehydroxyl radical scavenging rate，DPPH· scavenging rate，determination of reduction capacity，and determination of chelating ferrous ion capacity were used as in vitro antioxidant capacity evaluation indexes. The results showed that the antioxidant capacity of different lactic acid bacteria was different. The DPPH· scavenging rate of somatic cells was stronger than that of non-cell extracts. However，there was little difference between hydroxyl radical scavenging ability and ferrous chelation ability. The reduction ability of cell-free extract was stronger than that of bacteria. In general，the antioxidant capacity of strain 7-1 was better. Bacterial strains 7-1，3-3 and a-1 had strong antioxidant capacity. The non-cell extracts of strain 3-1，3-5，10-1 had strong antioxidant capacity. This study provided an excellent strain resource for the subsequent application research on the anti-oxidation of lactic acid bacteria.

Key words：lactic acid bacteria;bacterial cells;acellular extract;antioxidant activity;screening

0?? 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌不僅可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品的風(fēng)味，還可以提高食品保鮮和附加值，而且還具有特殊的生理活性。大量研究表明，乳酸菌可以降低血清膽固醇、控制內(nèi)毒素、制造營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、衰老過(guò)程等產(chǎn)生作用。由于乳酸菌具有諸多益生作用，人們對(duì)此加以重視并開發(fā)利用[2]。

氧化是肌膚衰老的最大威脅，還可引發(fā)心血管、關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病[3]。飲食不健康、日曬、環(huán)境污染、壓力等都可以讓機(jī)體內(nèi)自由基泛濫，從而使肌膚產(chǎn)生各種氧化現(xiàn)象。抗氧化物質(zhì)就是以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)的物質(zhì)，其可以直接作用在自由基上，也可以間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)[4]。人體中的抗氧化物質(zhì)一部分由自身合成，另外一部分由食物供給。乳酸菌作為一種研究較多的益生菌，能夠降低自由基的生成[5]，作為一種天然抗氧化劑具有較大的研究?jī)r(jià)值。

從皖北地區(qū)腌制咸菜（宿州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購(gòu)的腌制雪菜、豆角、白菜等）中分離出來(lái)的20株乳酸菌的基礎(chǔ)上，測(cè)定其菌體及無(wú)細(xì)胞提取物的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力、螯合亞鐵離子能力這4個(gè)抗氧化指標(biāo)，比較它們之間抗氧化活性的差異，篩選出具有高抗氧化活性的菌株，為后續(xù)研究提供優(yōu)良的菌種資源。

1?? 材料與方法

1.1?? 材料

1.1.1?? 試驗(yàn)菌株

20株乳酸菌，從皖北地區(qū)采集的腌制菜中篩選得到。

1.1.2?? 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：魚粉蛋白胨10 g/L，酵母粉5/L，牛肉浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.25 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3?? 主要試劑

焦性沒食子酸、七水合硫酸亞鐵、六水合三氯化鐵、六氰合鐵（III）酸鉀、水楊酸、DPPH試劑等，均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)。

1.2?? 試驗(yàn)方法

1.2.1?? 菌株的活化

20株乳酸菌菌株保存于含30%（V/V）甘油的MRS培養(yǎng)基中，于-80 ℃下保存，使用前按2%（V/V）接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)20 h，連續(xù)活化2次[6]。

1.2.2?? 乳酸菌無(wú)細(xì)胞提取物的制備

參考Liu C等人[7]的方法，并稍作修改。收集活化后的乳酸菌（4 ℃，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min），用PBS清洗2次后，重懸于PBS中，超聲破碎。超聲破碎條件設(shè)置為：功率60 W，工作3 s停8 s，共15 min。將超聲后的破碎液以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心20 min后取其上清液，經(jīng)過(guò)0.22 μm的濾膜過(guò)濾后得到無(wú)細(xì)胞提取物。

1.2.3?? 乳酸菌DPPH清除率的測(cè)定

取樣品1 mL，濃度0.2 mmol/L的DPPH-無(wú)水乙醇溶液1 mL，依次加入試管中，二者充分混勻后，于37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，隨后立即于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定制品的吸光度值，該方法用蒸餾水做空白對(duì)照[8]。自由基清除率計(jì)算方法如下：

式中：A1——空白管的吸光度;

A2——樣品管的吸光度。

1.2.4?? 乳酸菌羥自由基清除能力的測(cè)定

1，10 -菲羅啉2.5 mmol/L溶液、PBS（pH值7.4）和樣品溶液各加入1 mL，再加1 mL濃度2.5 mmol/L FeSO4溶液。充分混合后，加入1 mL濃度20 mmol/L的H2O2溶液。反應(yīng)混合物在37 ℃水浴中保持1.5 h。離心收集的上層清液是以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心??? 10 min，其波長(zhǎng)為536 nm。同時(shí)，按照上述方法，用1 mL PBS代替混合物中1 mL的樣品溶液作為空白對(duì)照組，測(cè)定536 nm處的吸光度[9]。自由基清除率計(jì)算方法如下：

式中：A1——對(duì)照組在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)得的吸光度;

A2——樣品管在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)得的吸光度。

1.2.5?? 乳酸菌還原能力的測(cè)定

取樣品0.5 mL，加入1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL后PBS（pH值6.6）。混合在50 ℃恒溫水浴20 min。從水浴中取出后，迅速在冰浴中冷卻。加入10%三氯乙酸溶液0.5 mL，混合離心，取上清液（以轉(zhuǎn)速 3 000 r/min離心10 min）。取上清液1 mL，加入0.1%氯化鐵溶液1 mL，拌勻。10 min后，以鹽酸半胱氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)，用蒸餾器代替混合物中的樣品于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)量水的吸光度[10]。吸光度越高，待測(cè)樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.6?? 乳酸菌螯合亞鐵離子的測(cè)定方法

加入0.1 mL抗壞血酸、0.1 mL硫酸亞鐵和100 mL硫酸亞鐵。2 mol/L的氫氧化鈉溶液，在37 ℃恒溫水浴20 min后，三氯乙酸沉淀的蛋白質(zhì)，以轉(zhuǎn)速??? 4 000 r/min離心10 min，取上清液0.2 mL，添加0.1%的鄰菲羅啉2 mL反應(yīng)10 min后，于510 nm處測(cè)量吸光度，OD值，同時(shí)做空白試驗(yàn)（PBS）[11]。

式中：P0——PBS系統(tǒng)OD值;

P1——樣品系統(tǒng)的OD值。

2?? 結(jié)果與分析

2.1?? 乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果見表1。

DPPH自由基清除率的測(cè)定是一種使用很廣泛的評(píng)價(jià)和篩選抗氧化劑抗氧化能力的方法。DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)[12]。試驗(yàn)測(cè)定了20株乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基的清除情況。20株菌株都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力?？傮w而言，菌體細(xì)胞DPPH自由基清除率要比無(wú)細(xì)胞提取物強(qiáng)。其中，菌株4-1，3-3的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基清除能力比較強(qiáng)，分別為61.24%，60.85%;菌株3-1，3-3的菌體細(xì)胞對(duì)DPPH自由基清除率較強(qiáng)，分別為56.98%，52.71%。

2.2?? 乳酸菌清除羥自由基能力的測(cè)定

乳酸菌清除羥自由基能力結(jié)果見表2。

羥基自由基是一種體內(nèi)氧化能力較強(qiáng)的自由基，可對(duì)大分子造成損傷。因此，清除羥自由基的能力也是衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)[13]。研究測(cè)定了不同乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基的清除能力，各菌株均表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除能力?？傮w看來(lái)，菌體和無(wú)細(xì)胞提取物清除羥自由基能力相差不大，其中菌株7-1和6-2的菌體對(duì)羥基自由基清除能力較強(qiáng)，分別為48.80%，47.06%;菌株7-1和5-3的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基清除能力較強(qiáng)，分別為50.93%，49.96%;菌株5-1的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基清除能力最低，為5.76%。

2.3?? 乳酸菌還原能力的測(cè)定

乳酸菌還原能力的測(cè)定結(jié)果見表3。

抗氧化能力與還原能力直接相關(guān)[14]，20株乳酸菌的菌體和無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力測(cè)定結(jié)果均顯示乳酸菌具有一定的還原能力，無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力相對(duì)于菌體的還原能力而言更強(qiáng)。其中，菌株1-2的菌體細(xì)胞的還原力相對(duì)較強(qiáng)，為0.233，而菌株6-2的菌體細(xì)胞最弱，為0.086;菌株3-5的無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力較強(qiáng)，為0.248，而菌株3-1的還原能力最低，為0.035。

2.4?? 乳酸菌螯合亞鐵離子的測(cè)定

乳酸菌螯合亞鐵離子的結(jié)果見表4。

由表4可知，20株乳酸菌均具有一定的螯合亞鐵離子的能力，但是菌體細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)亞鐵離子的螯合能力基本上差別不大。其中，菌株10-1的無(wú)細(xì)胞提取物螯合亞鐵離子能力最強(qiáng)，為65.56%，其次是6-2，為34.00%;菌株A-1的菌體細(xì)胞相對(duì)較好，為65.66%，而菌株4-1的則最差，為0.75%。

3?? 結(jié)論

乳酸菌的抗氧化作用與其對(duì)人體健康息息相?? 關(guān)[15]。試驗(yàn)以羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力的測(cè)定、螯合亞鐵離子能力的測(cè)定為體外抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)20株分離于皖北地區(qū)不同腌制菜中的乳酸菌為篩選源，比較其菌體細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，20株菌株中，菌體細(xì)胞的DPPH自由基清除率要比無(wú)細(xì)胞提取物強(qiáng)要強(qiáng)，而清除羥自由基能力和螯合亞鐵離子能力兩者相差不大，無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力相對(duì)于菌體細(xì)胞的更強(qiáng)?？傮w上，菌株7-1抗氧化能力較好。其中菌株7-1，3-3，A-1的菌體細(xì)胞抗氧化能力強(qiáng)，菌株3-1，3-5，10-1的無(wú)細(xì)胞提取物抗氧化能力強(qiáng)。在今后的研究中，可以對(duì)抗氧化能力強(qiáng)的乳酸菌采用細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，對(duì)其體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

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收稿日期：2019-07-14

基金項(xiàng)目：宿州學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目（KYLXYBXM19-098）;國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201910379048）。

作者簡(jiǎn)介：黃?? 煜（1997—?? ），女，本科，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

通訊作者：姚沛琳（1990—?? ），女，碩士，助教，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。