李亞娟,孟繁杰,羅麗雙,于月新,郝冬梅
(1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,沈陽 110016;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,沈陽 110016)
耳聾的病因復(fù)雜,是多種因素共同作用的結(jié)果。據(jù)報道,50%~60%的先天性耳聾與遺傳因素有關(guān)[1]。在遺傳性耳聾中,以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾約占70%,合并其他癥狀的綜合征型耳聾約占30%[2]。Usher綜合征(Usher syndrome,USH)是以先天性耳聾,視網(wǎng)膜色素變性,伴或不伴前庭功能障礙為特征的常染色體隱性遺傳疾病[3]。發(fā)病率為3.5/100 000~6.2/100 000[4]。Usher綜合征的基因型和表型具有臨床異質(zhì)性,分為USH1,USH2和USH3 3種臨床類型[5]。目前與USH1明確有關(guān)的基因有5個:MYO7A(USH1B)、USH1C(USH1C)、CDH23(USH1D)、PCDH15(USH1F)和USH1G(USH1G)[6]。
本研究應(yīng)用目標(biāo)基因捕獲和高通量測序技術(shù)快速高效地檢測出一個先天性耳聾家系的致病基因PCDH15,發(fā)現(xiàn)2個新突變位點(diǎn),確診先證者為USH1,并針對PCDH15基因突變?yōu)橄茸C者母親進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。
先證者,男,8歲,足月出生,先天性耳聾,出生后抬頭、翻身、坐、爬及行走等運(yùn)動發(fā)育遲緩,19個月學(xué)會走路,明顯落后于同齡幼兒,且平衡能力差,行走過程中經(jīng)常跌倒。經(jīng)過長期的平衡鍛煉后很少跌倒;2歲時行人工耳蝸植入獲得聽力,目前語言溝通能力良好;2.5歲發(fā)現(xiàn)視力異常,經(jīng)外院檢查為弱視和散光。先證者父母表型正常,非近親結(jié)婚,無家族遺傳病史。先證者母親再次懷孕,于孕18周進(jìn)行產(chǎn)前胎兒基因診斷。本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院(原中國人民解放軍第202醫(yī)院)倫理委員會批準(zhǔn),先證者父母簽署知情同意書?;颊呒蚁祱D見圖1。
1.2.1 樣本獲取和DNA提?。翰杉茸C者和父母全血2 mL,EDTA抗凝,應(yīng)用CWBIO BloodGen Midi Kit試劑盒提取DNA。先證者母親于孕18周在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹取羊水10 mL,應(yīng)用TIANGEN微量樣本基因組DNA提取試劑盒提取胎兒DNA。
圖1 Usher1綜合征家系圖Fig.1 Pedigree map of a family presenting congenital deafness
1.2.2 目標(biāo)基因捕獲和高通量測序:制備先證者DNA文庫,采用美國IDT公司的 xGen Exome Research Panel v1.0捕獲探針對耳聾相關(guān)基因全外顯子和相鄰內(nèi)含子(50 bp)區(qū)域進(jìn)行捕獲和富集,使用高通量測序平臺(Illumina hiseq X10)進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)采用the Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件與UCSC hg19人類參考序列進(jìn)行比對和鑒別遺傳變異,注釋信息包括堿基和氨基酸的保守性,生物學(xué)功能預(yù)測,正常人群分布頻率數(shù)據(jù)庫(DYDF、dbSNP、千人基因組、千人南方、千人北方和EXAC),人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD、OMIM和Clinvar)。
1.2.3 引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增:針對高通量測序篩選出的PCDH15基因突變位點(diǎn)設(shè)計上下游測序引物(表1)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,擴(kuò)增30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系為50 μL。
1.2.4 Sanger測序驗(yàn)證:針對PCDH15基因突變位點(diǎn),使用美國ABI 3730XL測序儀對先證者和父母進(jìn)行Sanger測序,采用DNASTAR軟件與參考序列(NM_001142771)進(jìn)行序列比對分析。
1.2.5 致病性預(yù)測:從美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)變異解讀規(guī)則、遺傳方式及臨床特征吻合度三方面分析篩選變異位點(diǎn),三方面都符合的突變判定為致病基因。
1.2.6 胎兒產(chǎn)前診斷:確定致病基因突變位點(diǎn)及來源后,利用上述測序引物及PCR反應(yīng)條件,通過Sanger測序?qū)μ貉蛩瓺NA進(jìn)行針對性突變檢測,確認(rèn)胎兒是否攜帶PCDH15基因突變。
表1 PCDH15基因驗(yàn)證位點(diǎn)的引物序列Tab.1 Primer sequence of PCDH15 gene verification site
檢測耳聾相關(guān)基因302個,測序量7 133 M,平均測序深度120.93%,覆蓋度99.95%,20×以上覆蓋度99.29%。結(jié)果顯示,先證者攜帶PCDH15基因第31號外顯子c.4115delG(p.G1372Efs*4)和第27號外顯子c.3490_3491insA(p.M1164Nfs*12)復(fù)合雜合突變。
先證者攜帶PCDH15基因第31號外顯子c.4115 delG(p.G1372Efs*4)和第27號外顯子c.3490_3491insA(p.M1164Nfs*12)復(fù)合雜合突變;先證者父親攜帶c.3490_3491insA(p.M1164Nfs*12)雜合性突變,母親攜帶c.4115delG(p.G1372Efs*4)雜合性突變。先證者的基因突變分別來源于父親和母親,該家系符合常染色體隱性遺傳,見圖2。
根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南,c.3490_3491insA和c.4115delG為移碼突變,屬于功能缺失型突變,是極強(qiáng)的致病證據(jù)。PCDH15基因是已知的USH1致病基因,與先證者臨床表型和遺傳方式高度吻合。因此,先證者診斷為USH1,PCDH15基因的復(fù)合雜合突變?yōu)樵摷蚁迪忍煨远@的致病基因。
檢索正常人數(shù)據(jù)庫(DYDF,dbSNP、千人基因組、千人南方、千人北方和EXAC),c.4115delG未見收錄,c.3490_3491insA(rs746865307)頻率為0.000 23(EXAC);檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD,OMIM和Clinvar)2種突變都未見報道。c.4115delG和c.3490_3491insA是PCDH15基因新的致病突變位點(diǎn)。
羊水DNA中檢測到胎兒攜帶PCDH15基因c.4115 delG(p.G1372Efs*4)和c.3490_3491insA(p.M1164Nfs*12)復(fù)合雜合突變,與先證者基因型相同,見圖2。
USH1在3種臨床類型中是最嚴(yán)重的,以先天性雙側(cè)感音性神經(jīng)耳聾,持續(xù)的前庭功能障礙和青春期前色素性視網(wǎng)膜炎為特征[7]。USH1患者前庭功能障礙臨床表現(xiàn)為運(yùn)動發(fā)育遲緩,患兒難以獨(dú)立坐穩(wěn),需他人幫助,于生后9~11個月可以獨(dú)坐,往往到18個月后才會走路[8-9]。本研究中,先證者先天性耳聾,各項運(yùn)動發(fā)育指標(biāo)落后,尤以會走路時間晚為顯著特征,并有視力異常,其臨床表型特征高度符合USH1臨床類型。
圖2 PCDH15基因Sanger測序結(jié)果和PCDH15蛋白功能結(jié)構(gòu)域Fig.2 Sanger sequencing of PCDH15 gene and the conserved domains of PCDH15
人類PCDH15基因編碼原鈣黏蛋白-15,含39個外顯子,1 955個氨基酸,包括胞外結(jié)構(gòu)域(多達(dá)11個胞外鈣黏蛋白重復(fù)序列),1個跨膜結(jié)構(gòu)域,以及細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD1、CD2或CD3)[10-11]。原鈣黏蛋白-15屬于鈣依賴性細(xì)胞黏附分子鈣黏著蛋白超家族[12],免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示其定位于內(nèi)耳毛細(xì)胞纖毛束和視網(wǎng)膜光感受器上[13]。聽覺和平衡覺依賴于內(nèi)耳毛細(xì)胞功能,位于毛細(xì)胞頂端的靜纖毛間的頂連接通過聲波和頭部運(yùn)動傳遞機(jī)械力,將機(jī)械信號轉(zhuǎn)換為電信號,從而打開毛細(xì)胞的機(jī)械電傳導(dǎo)通道。頂連接是由原鈣黏蛋白-15和鈣黏蛋白-23形成的細(xì)絲,PCDH15基因突變影響其相互作用,導(dǎo)致隱性形式的耳聾[14]。最新研究[15]發(fā)現(xiàn)原鈣黏蛋白15具有順式同源二聚體結(jié)構(gòu),是毛細(xì)胞感知機(jī)械刺激的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),PCDH15基因突變使其在毛細(xì)胞中的功能受到干擾。PCDH15基因錯義突變導(dǎo)致非綜合征性耳聾[10],而許多更嚴(yán)重的突變(移碼、無義、剪接、大片段缺失)則引起綜合征性耳聾,表現(xiàn)為聽力和前庭功能受損等。PCDH15基因突變都是分散的,沒有突變熱點(diǎn)[16]。
通過NCBI在線生物信息學(xué)分析軟件識別PCDH15蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,先證者攜帶的PCDH15基因c.3490_3491insA(p.M1164Nfs*12),由于1 bp的插入導(dǎo)致該蛋白第1 164位甲硫氨酸(M)突變?yōu)樘於0罚∟),繼續(xù)翻譯12個氨基酸序列后出現(xiàn)終止密碼子,蛋白翻譯提前終止,形成截短蛋白,失去部分鈣黏蛋白重復(fù)序列,該蛋白1 164位后的結(jié)構(gòu)域在真核生物高度保守,具有重要功能,該突變導(dǎo)致蛋白功能的失活具有致病性。c.4115delG(p.G1372Efs*4)由于1 bp的缺失導(dǎo)致該蛋白第1 372位甘氨酸(G)突變?yōu)楣劝彼幔‥),在1 375位提前終止翻譯,形成截短蛋白,丟失第1 375位后500多個氨基酸殘基,也可導(dǎo)致蛋白功能失活具有致病性。PCDH15基因的2個移碼突變可引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變,或者截短蛋白通過無義RNA介導(dǎo)的mRNA衰變途徑被降解,從而使內(nèi)耳毛細(xì)胞的頂連接失去功能,導(dǎo)致先證者耳聾的發(fā)生。
確定耳聾基因致病突變后,提取胎兒羊水DNA進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶c.4115delG(p.G1372Efs*4)和c.3490_3491insA(p.M1164Nfs*12)復(fù)合雜合突變,推測胎兒出生后會出現(xiàn)與先證者相同的表型,先證者母親知情選擇終止妊娠。
綜上所述,本研究檢出2個新的致病突變位點(diǎn)c.4115delG和c.3490_3491insA,豐富了PCDH15基因的突變譜。確診先證者為USH1,并針對PCDH15基因突變?yōu)橄茸C者母親進(jìn)行了產(chǎn)前診斷,為患病家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)。