趙 昕，張繼偉，陳國雄，李玉霖

(中國科學院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

為研究植物核酸分子在生命活動中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取核酸.核酸的主要組分為核糖核酸分子(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)，其純品呈白色粉末或結(jié)晶.

由于荒漠植物體內(nèi)含有大量的多糖、多酚、單寧酸和其它次級代謝物，因此荒漠植物具有強抗逆性.現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的運用對揭示荒漠植物強抵抗逆境的機制及其遺傳種質(zhì)資源的保護具有重要的作用，檢測不同環(huán)境脅迫下基因表達水平的變化為理解植物的抗逆性提供一些必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，高質(zhì)量DNA的提取是進行分子生物學基因表達研究的必要前提.

DNA提取方法有CTAB法[1]、高鹽低pH法[2]、SDS法[3]、蛋白質(zhì)變性和苯酚抽提法[4]等.然而，已有文獻都反映出分離高質(zhì)足量的DNA存在不同困難，主要表現(xiàn)在植物組織細胞破碎后，釋放出大量的多酚、多糖以及其它次級代謝物而干擾DNA的提取.多酚易氧化成多醌而與核酸結(jié)合，多糖在低離子濃度緩沖溶液中與DNA結(jié)合產(chǎn)生共沉淀，這些都導致DNA產(chǎn)量降低.不同植物組織中多糖、多酚以及其它次級代謝物含量的不同，顯著地影響著核酸的抽提及純化過程，因此研究荒漠植物抗逆機制及DNA提取方法是科技工作者必須解決的一個技術(shù)難題.

目前分子生物學實驗室常用的經(jīng)典方法以及各種生物公司出售的提取試劑盒，在針對模式植物擬南芥和水稻等的核酸提取時，效果較好.因為模式植物材料幼嫩、次生代謝產(chǎn)物少，能夠保證提取出高品質(zhì)高產(chǎn)量的核酸產(chǎn)物.但是荒漠高寒植物含有較多的多糖、蛋白質(zhì)、酚類、萜類等次生代謝產(chǎn)物，采用常規(guī)方法提取核酸時，勻漿過程中會釋放酚類物質(zhì)，氧化后與核酸穩(wěn)定的結(jié)合，形成難溶的膠狀物.同時萜類化合物和RNase會分別造成核酸的化學降解和酶解.

本文綜合各種已知方法的優(yōu)點，經(jīng)過改良，確保能夠提取到荒漠植物中高品質(zhì)DNA.本方法不僅能從常見荒漠植物中提取出高質(zhì)量的DNA，同時也適合于其它富含多糖、多酚以及大量次級代謝物植物DNA的高效提取，如提取水果果實、百合鱗莖中的DNA，具有廣泛的應用價值.此方法已經(jīng)獲得發(fā)明專利授權(quán)[5].

1 試驗部分

1.1 儀器

凝膠電泳系統(tǒng)，瓊脂糖水平電泳槽DYCP-31DN型(北京六一儀器廠)；全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)380C型(上海培清生物技術(shù)有限公司)；微量紫外分光光度計Nanodrop2000C型(Thermo-Fisher Sciencific公司).

1.2 試劑

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四乙酸乙二胺(EDTA)、β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP 6755)購自美國Sigma公司，瓊脂糖(Agarose)等購自蘭州鵬程生物科技公司，其他試劑均為國產(chǎn)化學級產(chǎn)品.

1.3 樣品

挑選騰格里沙漠南緣沙坡頭地區(qū)的常見荒漠植物沙米、紅砂、珍珠豬毛菜、檸條、沙冬青、油蒿、沙拐棗、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古蕕和霸王等植株，取其葉片立即凍存于液氮，貯存在-80 ℃冰箱備用.

1.4 DNA提取準備工作

提取試劑配制所用容器、提取所用研缽、藥匙和研杵等用高溫滅菌.制備DNA的離心管、槍頭等于120 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后烘干備用.電泳槽和梳子的處理：用去污劑清洗后，用水沖洗并用乙醇干燥，然后裝滿3%的H202溶液，室溫下處理10 min.操作過程中，帶手套口罩，無菌超凈工作臺上提取，研磨迅速，避免DNA受到污染.

1.5 溶液配置

交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP粉末)：購自Sigma公司；高壓滅菌鍋120 ℃ 20 min滅菌后，密封低溫保存；前處理緩沖液：200 mmol/L Tris-HCl+50 mmol EDTA+250 mmol/L NaCl +0.5-2%β-巰基乙醇(V/V)；提取裂解液：2% CTAB(W/V)+1.4 mol/L NaCl+0.02 mol/L EDTA+0.1 mol/L Tris-HCl+0.2-0.5%β-巰基乙醇(V/V)；pH 8.0；有機溶劑有純化液、異丙醇和乙醇.純化液組成為酚：氯仿：異戊醇(體積比為25∶24∶1，化學級，市售有機溶劑)；異丙醇為100%純度，分析化學級，市售有機溶劑；75%乙醇(V/V)，分析化學級；所有溶液都用高壓滅菌處理的超純水配置.

普通植物DNA提取試劑盒采用離心柱型普通DNA提取試劑盒(貨號DP305，北京天根公司).

2 荒漠植物葉片DNA提取

2.1 材料研磨

取荒漠植物葉片大約0.2～0.5 g，置于研缽中，在研缽中直接加上PVPP粉末，加入量為荒漠植物葉片質(zhì)量的0.5%～2%，充分研磨(可加入液氮)，至少研磨三次以上，將樣品粉末裝入2 mL微量滅菌離心管.

2.2 溶解除糖

加入前處理緩沖溶液，溶解多糖類物質(zhì).在研磨好的樣品粉末中迅速加入前處理緩沖液500～1 000 μL，渦旋儀上高速混勻，離心機上低速900 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀物.

2.3 萃取抽提

在沉淀物中加入500～1 000 μL的CTAB提取裂解液(經(jīng)60～70 ℃預熱)，渦旋儀上充分混勻，恒溫水浴鍋60～70 ℃溫浴1 h，充分震蕩混勻后高速離心機12 000 r/min離心10 min.抽提DNA清除多糖類產(chǎn)物.

CTAB提取液包含有較高濃度的CTAB(2%)、NaCl(1.4 mol/L)、β-巰基乙醇(0.2%～0.5%)以及25 mmol/L EDTA和100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0).CTAB是一種陽離子去污劑，能溶解細胞膜，對植物細胞具有較好的裂解作用，而且與β-巰基乙醇共同具有對蛋白質(zhì)的強烈變性作用，使核酸從蛋白-核酸復合物中徹底釋放出來.在高離子濃度的NaCl溶液中(NaCl>0.7 mol/L)，釋放出來的核酸與較高濃度的CTAB(2%，W/V)形成可溶性的復合物，而變性蛋白質(zhì)與CTAB形成不溶性的復合物，隨著氯仿的抽提,蛋白質(zhì)被去除.同時β-巰基乙醇不但可以作為強還原劑防止多酚氧化，提供pH值為8.0的緩沖環(huán)境，還能有效降低多酚物質(zhì)在酸性條件下被氧化的幾率.

2.4 純化萃取漂洗

取上清液，加入新的2 mL微量離心管，加等體積(800 μL)純化液混勻，抽提一次，室溫下，高速離心機上12 000 r/min離心5 min.

取上清液，加入新的2 mL微量離心管，加入1/2體積、預冷的異丙醇放入冰箱冷凍室，-20 ℃沉淀DNA 30～60 min.

取出2 mL微量離心管，在4 ℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5～10 min，棄去液體部分，取沉淀用75%乙醇清洗兩遍.

2.5 溶解保存

放入通風廚吹干至乙醇充分揮發(fā)，加入40～100 μL超純水溶解，貼標簽放入-18 ℃冰箱冷凍室凍存盒保存.

3 結(jié)果與討論

3.1 總DNA完整性檢測

每個樣品中取3 μL總DNA溶液通過凝膠電泳檢測其完整性，其它DNA樣品保存在-18 ℃冰箱中.將1 μL緩沖液和3 μL總DNA溶液室溫混合，然后進樣到1%瓊脂糖凝膠(已加2 μL溴化乙錠EB)樣孔中，在100 V電泳槽中電泳30 min，用全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)380C拍照記錄，結(jié)果如圖1所示，從左到右依次為檸條、沙米、紅砂、珍珠豬毛菜、霸王、油蒿、沙木蓼、沙冬青、蒙古蕕、沙拐棗、文冠果和花棒所提取的DNA電泳結(jié)果.由圖1可以看出，12種荒漠植物提取的DNA完整性良好.

圖1 12種荒漠植物提取的DNA電泳結(jié)果

3.2 總DNA產(chǎn)量和純度檢測

取1μL提取獲得的DNA溶液，用微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000C)測定OD260、OD280和OD230處的吸光值(以超純水為空白液調(diào)零)，計算DNA產(chǎn)量及純度.總DNA產(chǎn)量計算根據(jù)式(1)[6]：

DNA產(chǎn)量=50×OD260×樣品的體積(μL)/材料重(mg)

(1)

其中，DNA、蛋白質(zhì)和多糖、多酚分別在OD260、OD280和OD230具有最大吸光值，常用A260/230、A260/280的比值來表示DNA的純度.A260/230、A260/280的值在1.6～2.2之間，表示DNA具有較高的純度.A260/230低于1.8，說明DNA被多糖和多酚污染，A260/280低于1.8，說明DNA被蛋白質(zhì)污染.

采用本論文改進的試劑配方提取的12種荒漠植物DNA結(jié)果如表1所列.由表1可見，總DNA質(zhì)量濃度超過500 ng/μL，A260/230高于1.8，A260/280在1.6～2.2之間，表明所提取的DNA產(chǎn)量和純度均高.

采用市售普通植物DNA提取試劑盒提取12種荒漠植物DNA結(jié)果如表2所列.由表2可見，總DNA質(zhì)量濃度低于100 ng/μL，A260/230低于1.8，除了第一個樣品，其他樣品的A260/280均低于1.6，表明所提取的DNA濃度低，純度差.

從表1、2的結(jié)果比較可以看出，采用研磨過程中直接加入PVPP粉的方法，顯著提高了荒漠植物的DNA濃度.PVPP粉作為多酚化合物的螯合劑，具有很強的結(jié)合酚能力.在此試驗中特別提高了PVPP粉和前處理緩沖液中β-巰基乙醇的含量，使其質(zhì)量分數(shù)均達到0.5%～2%，β-巰基乙醇提供還原條件，二者協(xié)同作用，使得多酚類物質(zhì)不易被氧化，而與PVPP充分結(jié)合形成螯合物.再通過后續(xù)的步驟抽提除去，有效抑制了酚類物質(zhì)對DNA提取的影響.

表1 改良法12種荒漠植物DNA產(chǎn)量和純度測定結(jié)果

表2 普通植物DNA提取試劑盒12種荒漠植物DNA產(chǎn)量和純度測定結(jié)果

對照試驗中采用的試劑盒沒有加入PVPP粉，因此導致DNA提取濃度低的原因是其采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP).PVP水溶性好，可溶于各種有機溶劑，而PVPP是交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，是聚乙烯吡咯烷酮的交聯(lián)聚合物，幾乎不溶于任何溶劑.不溶性PVPP替代可溶性的PVP，可溶性PVP與酚的抽提不兼容而干擾DNA沉淀.不溶性PVPP在提取第一步的研磨時立即結(jié)合多酚，從而阻止核酸與多酚結(jié)合，可以避免DNA產(chǎn)量減少.而且PVPP不影響萃取純化過程，因此提高了DNA的產(chǎn)量和純度.

4 結(jié)論

本方法操作簡單，耗時少，操作過程大約2～3 h.DNA損失少，產(chǎn)量高，DNA質(zhì)量濃度大于500 ng/μL.

本方法提取的荒漠植物DNA純度高.荒漠植物富含多酚、多糖、蛋白質(zhì)等次級代謝物，為了使提取的DNA純度高，操作過程中首先在材料研磨時使用PVPP粉充分結(jié)合多酚進而通過氯仿/異戊醇抽提徹底去除多酚.通過使用高鹽的前處理緩沖液去除大部分多糖.

本方法提取的荒漠植物DNA完整性好.由于改良CTAB法能徹底去除多糖、多酚、蛋白質(zhì)、RNA及其它污染物，所提的DNA適合分子生物學的下游試驗，如反轉(zhuǎn)錄及基因擴增等，所以改良CTAB法是提取荒漠植物總DNA的最理想方法，為后續(xù)開展荒漠植物分子克隆和基因表達分析等分子生物學試驗奠定了基礎(chǔ).

本技術(shù)不僅能從常見荒漠植物中提取出高質(zhì)量的DNA，同時也適合于其它富含多糖、多酚以及大量次級代謝物的植物DNA的高效提取，如提取水果果實、百合鱗莖中DNA，具有廣泛的應用價值.